Las manoproteínas son una herramienta muy interesante para corregir algunos defectos de los vinos, la posibilidad de diseñar su estructura abre nuevas perspectivas

Utilizando mutantes no transgénicos de Saccharomyces cerevisiae que sintetizan manoproteínas con estructura alterada y técnicas de genética clásica para combinar las mutaciones, se pueden diseñar levaduras que produzcan manoproteínas con estructuras 'a la carta'. Si se consigue establecer una relación precisa estructura-efecto, se podrían obtener manoproteínas muy variadas y específicas para corregir defectos concretos de los vinos y aproximarnos al 'vino perfecto'.

Las levaduras están rodeadas por una pared celular rígida que tiene importantes y vitales funciones: protege a las células de la lisis osmótica y de las condiciones adversas del medio externo; es responsable de las morfologías características de diferentes procesos como gemación, formación de pseudohifas, conjugación o esporulación; determina las características antigénicas de la levadura y juega un papel fundamental en las interacciones con otras células para formación de biopelículas, o con los hospedadores, en el caso de levaduras patógenas [1, 2]. En S. cerevisiae representa entre el 15 y el 30% del peso seco celular y está compuesta fundamentalmente por dos tipos de macromoléculas: glucano, un polímero de glucosa que forma cadenas largas y constituye el componente rígido, al que se une el segundo componente: las manoproteínas (Figura 1A). También posee una pequeña cantidad de quitina (1-2%).

Cuando la levadura finaliza el proceso fermentativo, tras algún tiempo en ausencia de nutrientes, sufre procesos de autofagia, muerte celular y finalmente autolisis irreversible [3, 4]. Durante el proceso de autolisis actúan enzimas degradativas como proteasas, glucanasas, quitinasas, etc., liberando al medio diferentes macromoléculas, entre las que se encuentran las manoproteínas (Figura 1B).

Manoproteínas de S. Cerevisae: estructura

Las manoproteínas son glicoproteínas cuya porción glucídica está constituida casi exclusivamente por manosa y suele representar entre el 5-90% de la molécula. Su estructura molecular se ha estudiado a fondo en S. cerevisiae. En esta levadura, las cadenas unidas por enlace O-glicosídico contienen cadenas lineales con un máximo de 5 manosas, mientras que las unidas por enlace N-glicosídico son mucho más grandes con 2 moléculas de N-Acetil glucosamina, numerosas manosas (pueden llegar a >100) en cadenas ramificadas y algunos grupos fosfato diesterificados [5, 6] (Figura 2). Las cadenas de N-oligosacáridos son las principales responsables de las propiedades de interés enológico de las manoproteínas.

Figura 2. estructura de las cadenas glucídicas de las manoproteínas en S. cerevisiae se muestran los n-oligosacáridos unidos a residuos de asn de la proteína y los o-oligosacáridos, mucho más cortos, unidos a ser o thr.

Durante la fermentación, cuando las levaduras se dividen activamente, liberan al medio pequeñas cantidades de manoproteínas. Sin embargo, como ya se ha indicado, la liberación masiva se produce cuando la levadura muere y sufre el proceso de autólisis. Esto ocurre cuando las levaduras se mantienen durante largos periodos en contacto con el vino después de finalizada la fermentación, por ejemplo, en vinos sometidos a crianza sobre lías y en espumosos elaborados por el método tradicional. En ambos casos, el resultado es muy apreciado y a ello parecen contribuir de manera notable las manoproteínas.

En los últimos años se han realizado numerosos estudios encaminados a determinar el efecto concreto de las manoproteínas sobre las características del vino. Se citan a continuación algunos representativos: (a) Disminución de la astringencia, mejora de la sensación en boca y estabilidad del color en vinos tintos [7-9]; (b) Aumento de la persistencia de compuestos aromáticos [10, 11]; (c) Mejoran de la estabilidad tartárica y proteica [12, 13]; (d) Dificultan el crecimiento de bacterias acéticas y favorecen el desarrollo de bacterias lácticas [14]; (e) Mejoran las características de la espuma en vinos espumosos [13, 15].

En varios de los trabajos previos se ha puesto de manifiesto que el efecto de las manoproteínas sobre los vinos puede variar dependiendo del microorganismo de procedencia [16], de las condiciones de producción [13] o de su tamaño molecular [12, 14]. Sin embargo, la mayor parte de las manoproteínas disponibles en el mercado suelen ser preparaciones crudas a partir de levaduras en las que no se especifica su estructura.

Con el fin de encontrar una relación entre la estructura de las manoproteínas y su efecto sobre las características del vino, hemos utilizado mutantes no transgénicos de S. cerevisiae que sintetizan manoproteínas con estructura alterada y conocida (mnn, mannan defective): mnn1, mnn2, mnn5, mnn6, mnn9 y mnn10, todos ellos haploides de los dos tipos sexuales 'a' y 'alfa' [5]. Los defectos que presentan cada uno de ellos se muestran en la Figura 3.

Utilizando técnicas sencillas de genética clásica, se han hibridado mutantes simples de distinto tipo sexual para conseguir levaduras diploides con combinaciones de 2 o más mutaciones y obtener así manoproteínas con la estructura deseada. Las tétradas de estas levaduras diploides se diseccionaron con un micromanipulador acoplado a un microscopio para separar las esporas, y los clones-espora correspondientes se analizaron por aglutinación con anticuerpos anti-wt, tamaño de las colonias, tinción con azul alcian (Figura 4) y, cuando fue necesario, tamaño de la enzima invertasa secretada por la levadura (no se muestra).

Los anticuerpos (Ac) frente a la cepa silvestre reconocen principalmente las manosas terminales unidas por enlaces alfa 1,3. Estas manosas no están presentes en las estirpes con la mutación mnn1 por lo que los Ac no aglutinan con ellas, pero sí aglutinan, aunque menos que con el silvestre, con estirpes con otras mutaciones como mnn2 o mnn9 (Figura 4). Los mutantes con los defectos más drásticos, como mnn9, crecen más lentamente que la estirpe silvestre y forman clones-espora claramente más pequeños (Figura 4B). Finalmente, las células con defectos en la fosforilación de los N-oligosacáridos, como mnn6, carecen de carga en la superficie celular y no se tiñen con el colorante catiónico azul alcian (Figura 4C).

En la Figura 5 se muestran las estructuras de los N-oligosacáridos sintetizadas por algunos mutantes dobles (clones-espora) representativos. El mutante mnn2mnn6 (Figura 5A) carece de grupos fosfato (mnn6) y la cadena externa no tiene ramificaciones (mnn2). El mutante mnn2mnn10 (Figura 5B), presenta una cadena externa más corta que la cepa silvestre (mnn10) y sin ramificaciones (mnn2). El mutante mnn1mnn5 (Figura 5C) carece de manosas terminales unidas por enlace alfa 1,3 (mnn1) y presenta ramificaciones de una sola manosa en la cadena externa (mnn5). Finalmente, el mutante mnn1mnn9 (Figura 5D) es el que presenta un defecto más drástico: carece de manosas terminales unidas por enlace alfa 1,3 (mnn1) y carece casi completamente de cadena externa (mnn9).

Otro factor a considerar es el grado de pureza de las manoproteínas extraídas de los mutantes. El proceso de extracción-purificación consta de varias etapas que incluyen una primera solubilización en caliente a partir de las células de levaduras, varias precipitaciones e incluso una cromatografía final [5, 6]. Las manoproteínas completamente puras se utilizan para realizar estudios estructurales precisos, pero no sería necesario completar todo el proceso para el estudio de sus efectos sobre el vino. Aunque podrían utilizarse preparaciones crudas, parece más adecuado utilizar una etapa de purificación intermedia, estudiando su rentabilidad a la hora de una posible comercialización.

Numerosas empresas enológicas comercializan manoproteínas para corregir determinados defectos en los vinos o simplemente para mejorar sus características organolépticas. En la mayor parte de los casos, lo que se comercializa son preparados obtenidos a partir de levaduras, o incluso la propia levadura seca, sin especificar estructuras ni grado de pureza, aunque de los estudios previos se deduce que algunos efectos concretos dependen la naturaleza y características de la manoproteína.

La metodología que se presenta en este trabajo, permite obtener estirpes de S. cerevisiae que sintetizan manoproteínas con una estructura concreta y diseñada previamente. Con ellas se pretende establecer una relación entre la estructura (fundamentalmente tamaño y carga) y su efecto sobre estabilidad tartárica, proteica y del color, interacciones con compuestos aromáticos, astringencia y sensación en boca, efecto sobre el crecimiento de bacterias acéticas y lácticas y efecto sobre la capacidad espumante en vinos espumosos. Esto nos permitiría aplicar exclusivamente el tipo de la manoproteína necesaria en cada caso y conseguir así correcciones precisas que nos acercarían a conseguir un vino libre defectos.

Aunque la utilización de mutantes sencillos y múltiples de S. cerevisiae nos permitirá conseguir una batería de estructuras tremendamente amplia, la misma metodología podría extenderse en el futuro a levaduras no-Saccharomyces, ampliando aún más la variedad de manoproteínas disponibles.

Este trabajo ha sido financiado por el proyecto IB16132 (Consejería de Economía e Infraestructuras, Junta de Extremadura). Patricia Gil es receptora de una beca predoctoral de la Junta de Extremadura.

Referencias

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