Las cepas de C. coli son más productoras de biofilm que las cepas de C. jejuni

Campylobacter es el principal causante de enfermedades gastrointestinales bacterianas asociadas a los alimentos. En este artículo se demuestra que la capacidad de Campylobacter de formar biofilm en superficies abióticas puede ser una herramienta de prevalencia de este patógeno en la cadena alimentaria de la carne de pollo. Los resultados obtenidos han demostrado además que las cepas aisladas de superficies limpias producen más biofilm que las asiladas de ambientes sucios. Finalmente, se observó que la especie C. coli fue capaz de formar más biofilm que la especie C. jejuni, lo que podría indicar la emergencia de cepas más virulentas de esta especie.

Los biofilms son matrices poliméricas producidas por diversos microorganismos que les permiten adherirse a una superficie y crear un entorno adecuado para la expresión de características fenotípicas que les confieren adaptabilidad medioambiental y una mayor resistencia al estrés ambiental (Gambino y Cappitelli, 2016). Los biofilms pueden colonizar superficies bióticas y abióticas, causando efectos beneficiosos y/o perjudiciales para el medio ambiente, la industria y la salud humana. Un ejemplo de una explotación beneficiosa de los biofilms sería su papel en las depuradoras de aguas residuales (Nicolella, 2000). Sin embargo, en la industria alimentaria la presencia de biofilms constituye un evidente riesgo para la salud humana, debido a que los mismos pueden contener microorganismos patógenos, incrementando la resistencia a la desinfección y por tanto las probabilidades de contaminación del producto y de provocar enfermedades de transmisión alimentaria (Shi y Zhu, 2009). Entre los microrganismos patógenos asociados a los alimentos, Campylobacter es desde hace varios años y a nivel mundial, la causa más frecuente de enfermedades diarreicas de origen bacteriano (Gañan y col., 2012). Según la máxima Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) en el año 2015 se confirmaron 29.213 casos de campilobacteriosis en la Unión Europea. Con respecto a España, y a pesar de que no es una enfermedad de declaración obligatoria por parte del Sistema Nacional de Salud, se reportaron 13.227 casos confirmados, aunque se considera que el número real de casos debe de ser mucho mayor a los confirmados (EFSA, 2017).

Campylobacter es parte de la microbiota normal del tracto gastrointestinal de diferentes especies de mamíferos y aves, siendo las aves de corral, y en especial el pollo, la fuente primaria de infección humana por Campylobacter. Según varios estudios epidemiológicos realizados, se considera que hasta el 80% de las canales de pollo que se comercializan podrían estar contaminadas por Campylobacter, a pesar de los requerimientos específicos que necesita esta especie para poder crecer (Gañan y col., 2012). Campylobacter es un microorganismo que requiere de una atmósfera reducida de oxígeno, siendo sus condiciones óptimas de crecimiento la presencia de un 5% de oxígeno, 10% de dióxido de carbono y 85% de nitrógeno (Humphrey y col., 2007). Campylobacter es un microorganismo que no crece a temperaturas por debajo de los 30°C y es muy susceptible a las diversas condiciones de estrés que se dan en la cadena alimentaria, por lo que no es capaz de multiplicarse en los alimentos. A pesar de todas estas aparentes limitaciones, Campylobacter es el principal patógeno bacteriano asociado a los alimentos, lo que constituye toda una paradoja microbiológica (Murphy y col., 2006). A esta capacidad de sobrevivir en la cadena alimentaria contribuyen diversos atributos de virulencia que emplea este patógeno como herramientas para provocar la enfermedad en humanos, denominada campilobacteriosis (Koolman y col., 2015). Entre estos atributos de virulencia, se ha descrito que la capacidad de formar biofilm podría ser una característica muy relevante del genero Campylobacter para sobreponerse a los diferentes tipos de estrés presentes en la cadena alimentaria.

En este trabajo, el objetivo principal ha sido determinar la capacidad de diferentes cepas de Campylobacter de formar biofilm. Se utilizaron cepas aisladas tanto de la cadena alimentaria de la carne de pollo, así como de pacientes de hospital, con el propósito principal de evaluar el impacto de la capacidad de formar biofilm en la virulencia de este patógeno alimentario.

Para el desarrollo de este estudio se utilizaron un total de 50 cepas de Campylobacter: 29 cepas aisladas de la cadena alimentaria (CA) de la carne de pollo (23 cepas de C. jejuni y 6 cepas de C. coli) y 21 cepas aisladas de casos clínicos (H) de campilobacteriosis (16 cepas de C. jejuni y 5 cepas de C. coli). Todos los aislamientos se realizaron en la provincia de Burgos entre los años 2011 y 2014. Las cepas se conservaron y almacenaron a -80 °C hasta su utilización. Para la realización de los ensayos se utilizaron los siguientes medios de cultivo para el crecimiento de Campylobacter: como medio líquido se utilizó caldo Brucella Broth (BB) (Becton Dickinson) y como medio sólido agar Müeller-Hinton suplementado con un 5% de sangre de cordero desfibrinada (MHS) (Becton Dickinson) (Figura 1). Las diferentes cepas se recuperaron por siembra en placas de MHS y se incubaron en condiciones de microaerofilia (85% N₂, 10% CO₂ y 5% O₂) utilizando un incubador de atmósfera variable (VAIN MACS-VA500, Don Whitley Scientific) a una temperatura de 42 °C durante 48 horas. Para la obtención de los inóculos experimentales se tomaron colonias aisladas y se inocularon en 50 mL de BB, posteriormente estos cultivos se incubaron con agitación constante (130 rpm) durante 24 horas en las condiciones atmosféricas y de temperatura mencionadas anteriormente.

Figura 1. Apariencia de las colonias de Campylobacter creciendo en medio sólido Mueller-Hinton sangre (MHS).

Para la determinación de la capacidad de Campylobacter de formar biofilm en superficies abióticas se utilizó un método basado en el protocolo descrito previamente por Reeser y colaboradores (2007) con ligeras modificaciones realizadas para el presente trabajo. En el método se emplearon placas de 24 pocillos de poliestireno (Sarstedt), y de forma resumida, para el desarrollo del mismo se siguieron los siguientes pasos: en placas de 24 pocillos se añadió 1 mL por pocillo del cultivo bacteriano y se incubó a 30 °C sin agitación y en condiciones de aerobiosis durante 48 horas. Posteriormente, se retiró el medio por aspiración y se secó la placa a 55 °C durante 10 minutos. Seguidamente, el biofilm formado en cada pocillo se tiñó y se secó con una solución de cristal violeta (0,1%) durante 5 minutos y se lavó dos veces utilizando agua destilada (Figura 2). Se decoloró con una solución mezcla de etanol-acetona (80:20%) durante 5 minutos y de esta solución se tomaron 100 µL que se trasvasaron a una placa de 96 pocillos (Sarstedt) para leer la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de microplacas (Synergy HT, Biotek). Los resultados obtenidos se expresaron como el porcentaje de la capacidad de formar biofilm (% CFB) de cada cepa con respecto a su control de crecimiento (UFC/mL). Se utilizó la siguiente fórmula para su determinación: CFB=Biofilm (??570)/(UFC/mL)x100

Como control de formación de biofilm entre experimentos se utilizó la cepa de referencia C. jejuni NCTC 11168 (National Collection of Type Cultures, Reino Unido).

Figura 2. Aspecto de biofilms producidos por diferentes cepas de Campylobacter teñidos con solución de cristal violeta (0,1%) en placa de ensayo.

En la Figura 3 se representa la comparación de los valores medios de formación de biofilm entre las cepas de Campylobacter aisladas de la cadena alimentaria de la carne de pollo (CA) y las cepas clínicas (H). Como se puede observar, las cepas aisladas de la cadena alimentaria formaron mayor cantidad de biofilm que las cepas de origen clínico, lo que sugiere que la capacidad de formar biofilm podría ser una herramienta utilizada por las cepas alimentarias para incrementar su virulencia y perdurar a lo largo de toda la cadena alimentaria de la carne de pollo. Este comportamiento es coherente con el hecho de que como parte de este experimento se han aislado cepas de Campylobacter a lo largo de toda la cadena alimentaria, desde las granjas de producción hasta las canales o derivados de pollo que se venden al consumidor, lo que demuestra su presencia en toda la cadena alimentaria de la carne de pollo. Al igual que ocurre con otras especies bacterianas, se ha descrito que Campylobacter es capaz de formar biofilms en diferentes materiales como acero inoxidable y plásticos que se pueden encontrar habitualmente en diferentes partes de las plantas de procesado o formando parte de los sistemas de agua potable en las explotaciones avícolas (Joshua y col., 2006). Sin embargo, el hecho de que las cepas clínicas formen menos biofilm podría indicar que este atributo de virulencia es menos relevante para el patógeno a la hora de infectar al ser humano.

Especialmente interesante resultó el hecho de que las cepas de C. coli fueron más productoras de biofilm que las cepas de C. jejuni (Figura 4). La mayoría de los casos documentados de campilobacteriosis a nivel mundial se deben a la especie C. jejuni, que representa aproximadamente el 90% de los aislamientos confirmados, asociándose el 10% restante de los casos a la especie C. coli (Gañan y col., 2012). Sin embargo, en los últimos años se ha reportado en todo el mundo la emergencia de cepas de C. coli resistentes a diversos antibióticos, incluyendo macrólidos como la eritromicina, el cual se considera la principal opción terapéutica en el caso de la campilobacteriosis (Wieczorek y col., 2015). El hecho de que esta especie presente además atributos de virulencia específicos como es una mayor capacidad de formar biofilm, la convierte en una candidata potencial a ser considerada en el futuro como una protagonista de mayor relevancia en la infección humana por Campylobacter.

Como hemos comentado previamente, no se conoce exactamente cómo Campylobacter logra superar todas las desventajas relacionadas con su limitada capacidad de supervivencia al estrés para sobrevivir en el medio ambiente y en la cadena alimentaria y ser capaz de causar enfermedad en humanos. Sin embargo, si se ha descrito que la capacidad de formar biofilm puede jugar un papel muy significativo en la resistencia a desinfectantes y otros productos de limpieza utilizados en granjas, mataderos y plantas de procesado (Teh y col., 2014). Con este propósito, comparamos la capacidad de formar biofilm de ocho cepas de C. jejuni aisladas de dos lugares diferentes de la cadena alimentaria de la carne de pollo, jaulas y máquinas desplumadoras, antes y después de su higienización por parte de los operarios. Los resultados obtenidos se representan en la Figura 5. En este ensayo se observó cómo las cuatro cepas aisladas de superficies limpias (SL) fueron capaces de producir más biofilm que las cuatro cepas aisladas antes de realizar la limpieza (superficies sucias, SS), lo que evidencia que la producción de biofilm podría contribuir a la resistencia de este patógeno a los protocolos de higienización, y por tanto ser una estrategia relevante en la prevalencia de Campylobacter en la cadena alimentaria de la carne de pollo.

• Las cepas de Campylobacter provenientes de la cadena alimentaria de la carne de pollo produjeron más biofilm que las cepas infectivas aisladas de pacientes con campilobacteriosis.
• Las cepas utilizadas de la especie C. coli produjeron más biofilm que las cepas de C. jejuni, lo que podría indicar la emergencia de cepas más virulentas de esta especie.
• Las cepas de Campylobacter aisladas de superficies limpias de la cadena alimentaria de la carne de pollo produjeron más biofilm que las cepas aisladas en los mismos sitios antes del proceso de higienización, lo que indica que esta podría ser una estrategia relevante en la prevalencia de Campylobacter en la cadena alimentaria de la carne de pollo.

Este estudio ha sido financiado por el proyecto AGL2013-47694-R del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Los autores agradecen al Dr. J. Rovira (Universidad de Burgos) por su ayuda en el aislamiento de las cepas de Campylobacter.

Referencias bibliográficas

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