Trabajo presentado en el XIII Congreso de la Sociedad Española de Ciencias Hortícolas

Clasificación de uvas según su densidad en estudios de expresión génica en la maduración

Pablo Carbonell-Bejerano^1,2; Virginia Rodriguez¹; Silvia Hernáiz²; Gema Bravo¹; Carolina Royo^1,2; Jerome Grimplet²; y José M. Martínez-Zapater^1,2 ¹Departamento de Genética Molecular de Plantas, Centro Nacional de Biotecnología (CNB- CSIC)²Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (ICVV-CSIC), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)23/07/2012

Las condiciones ambientales influyen en la maduración de la uva y en su composición, determinando su calidad para procesos de vinificación. Los factores ambientales que afectan a la maduración pueden provocar en la baya cambios de expresión génica relacionados con los efectos sensoriales, de modo que, estudios transcriptómicos pueden ser útiles para comprender cómo el ambiente influye sobre la maduración, así como para identificar biomarcadores del grado de madurez y de situaciones de estrés en la uva.

Para comparar uvas maduradas en distintas condiciones de cultivo (tanto a nivel de expresión génica como a otros niveles) es imprescindible poder discernir los efectos cualitativos originados por la condición de aquellos derivados de desplazamientos fenológicos, ya que situaciones de estrés ambiental también aceleran la fenología de la maduración. Con el objetivo de poder paliar desplazamientos fenológicos en futuras comparaciones, en este trabajo se testó como método no invasivo de determinación del grado de madurez la clasificación de uvas de las variedades ‘Tempranillo’ y ‘Albariño’ según su densidad, estimada utilizando una serie de soluciones de NaCl. Se corroboró la correlación entre la densidad de la baya y varios parámetros indicativos de la madurez. En un análisis transcriptómico global se identificaron diferencias de expresión génica significativas entre bayas de distinta densidad, pese a proceder de los mismos racimos y ser recolectadas en el mismo momento. Las funciones de los genes expresados diferencialmente concuerdan con estados de madurez diferentes y son consistentes entre distintas condiciones de cultivo, viñedos, variedades y años, identificándose también algunas diferencias específicas de cada variedad.

Introducción

La baya de la vid sigue un proceso de maduración caracterizado por una serie de cambios que incluyen aumento de tamaño, ablandamiento, metabolización de ácidos orgánicos, acumulación de azúcares, cambios en el contenido de sustancias aromáticas, incremento del contenido en polifenoles y en las variedades tintas, adquisición de color, generalmente en el hollejo. Estos procesos van a su vez acompañados por una serie de cambios en la expresión génica de la uva [1,2] que junto con la interacción con el ambiente son los que determinan el desarrollo de la maduración y por tanto el aspecto y composición de la baya (Fig. 1). Todas las células de la uva, independientemente de su estado de desarrollo y al igual que el resto de la planta, comparten el mismo genoma y por tanto codifican los mismos genes.

Durante la maduración, en cada tipo celular, dependiendo del estado de desarrollo y del ambiente se transcribe un grupo de genes concretos, cada uno a unos niveles concretos [3-5]. El conjunto de transcritos expresados en una condición concreta se denomina transcriptoma. Gracias a la lectura de la secuencia completa del genoma de la vid [6] se han podido identificar los cerca de 30.000 genes que codifica. Este conocimiento se ha aprovechado para diseñar micromatrices que contienen sondas de ADN para cada uno de los genes de la vid, de modo que permiten analizar la expresión génica a nivel global sobre todo el genoma [7]. La aplicación de esta herramienta para comparaciones transcriptómicas en estudios de maduración puede ser útil para caracterizar distintos grados de madurez, así como el efecto de distintas condiciones de cultivo. El análisis sistemático de este tipo datos podría permitir la identificación de genes cuyos perfiles de expresión se repitan reproduciblemente ante condiciones concretas, de modo que podrían emplearse como biomarcadores de estados de madurez, situaciones de estrés o déficits nutricionales.

Figura 1: Esquema de la aplicación de la transcriptómica para estudiar el efecto de las condiciones ambientales sobre la maduración de la uva.

La maduración de la vid no transcurre sincrónicamente en un mismo viñedo, ni en una misma planta, e incluso dentro de un mismo racimo coexisten uvas de diversos grados de madurez [8]. Además, condiciones ambientales estresantes relacionadas con el cambio climático, como las altas temperaturas o el déficit hídrico, afectan a la fenología, usualmente acelerando la maduración [9]. Dada esta heterogeneidad, a la hora de estudiar la influencia de condiciones ambientales sobre la maduración, se hace necesario un método que permita seleccionar bayas representativas que presenten el mismo estado de madurez y por tanto sean comparables entre distintas condiciones de cultivo/tratamientos, viñedos, años, etc. También es necesario que este método de selección sea no destructivo de modo que no impida realizar los análisis requeridos sobre las bayas seleccionadas. Pese a que actualmente existen sofisticados métodos no invasivos de estimación del grado de madurez como los basados en espectroscopía infrarroja [10], un método más asequible puede ser la evaluación de la densidad [11]. La densidad de la uva aumenta durante la maduración al incrementar su concentración de azúcares, y por tanto puede emplearse para clasificar el estado de madurez. Algunos trabajos científicos previos en vid [12,13] e incluso procesos vitícolas de selección de uvas para producción de vinos de alta gama han utilizado series de soluciones de solutos inocuos como el NaCl o la sacarosa para evaluar la densidad de las uvas de manera no invasiva según su flotación en las mismas.

En el grupo de Genética y Genómica de la vid del ICVV hemos trabajado en la línea troncal del proyecto Cenit Deméter con el objetivo de evaluar el efecto de condiciones ambientales de cambio climático como el incremento de temperatura y la menor disponibilidad de agua sobre la expresión génica de uvas de ‘Tempranillo’ y ‘Albariño’ a lo largo del proceso de maduración. El primer paso en los objetivos del proyecto fue la evaluación del sistema de la serie de soluciones de NaCl como método de selección de estados de madurez comparables. En el presente trabajo se evaluó la correlación entre la densidad y la maduración determinando distintos parámetros relacionados y se caracterizó la expresión génica en bayas de tres densidades distintas.

Materiales y métodos

- Material vegetal: Se emplearon plantas de los cultivares ‘Tempranillo’ y ‘Albariño’ cultivadas en condiciones de riego controlado en invernadero o en condiciones de campo con o sin riego. Se recogieron frutos a lo largo de la maduración entre las temporadas 2009-2011.

- Clasificación de bayas según su densidad: Se separaron las bayas de los racimos a estudiar cortando sus pedúnculos y se sometieron a una serie de soluciones de NaCl para determinar su densidad. Se introdujo el conjunto de bayas en la solución de mayor densidad de la serie, pasando las que flotaban en la superficie a la solución de segunda mayor densidad y dejando las hundidas en el fondo y así sucesivamente hasta tener todas las bayas clasificadas. Las bayas recogidas clasificadas se lavaron con agua destilada, se secaron con papel de filtro y se procedió inmediatamente a la cuantificación de los distintos parámetros fisiológicos (de todas las bayas de dos racimos por cada cultivar). Se empleó un refractómetro de mesa para la determinación del contenido en sólidos solubles (CSS). Las bayas a emplear en los análisis de expresión génica fueron ultracongeladas en N₂ líquido directamente tras el secado y se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento.

- Análisis global de la expresión génic: Se pulverizó el conjunto de piel y pulpa de 7-8 bayas de cada muestra tras desechar las semillas y evitando su descongelación. Se obtuvo ARN utilizando un protocolo de extracción específico para vid [14]. Se utilizó la micromatriz de Nimblegen Vitus exp. HX12 con sondas de ADN representativas de todos los genes anotados sobre la secuencia genómica de la vid. Nuestro grupo intervino en la anotación de la función molecular de cada uno de los genes y su categorización funcional in silico [15]. Se empleó el protocolo de hibridación recomendado por los fabricantes. Se realizó una normalización ‘Robust Multi-array average’ sobre las intensidades de hibridación medidas. La identificación de genes diferenciales se realizó mediante análisis estadístico ‘Significance Analysis of Microarrays’ (SAM) y el algoritmo ‘Self-Organizing Maps’ (SOM) para el agrupamiento de genes según sus perfiles de expresión.

Resultados y discusión

En primer lugar, utilizando racimos de envero, se evidenció que cada racimo presenta una amplia diversidad de bayas en cuanto su estado de madurez, determinado mediante diferentes parámetros tales como el CSS, dureza, peso, longitud y diámetro de baya y superficie de la baya coloreada en ‘Tempranillo’ (Fig. 2). Esta diversidad confirma la necesidad de un método de muestreo que permita fijar el estado de madurez. Entre los parámetros cuantificados, el que mejor reflejó la acumulación de azúcares con la maduración (CSS) fue la distribución de las bayas en soluciones de distinta densidad. Algunos trabajos proponen que la estimación visual del color es el mejor indicador del estado de madurez en variedades coloreadas [16]. Sin embargo, en nuestro análisis de ‘Tempranillo’ se halló una mayor correlación CSS-densidad que entre CSS y color. De hecho, densidad-color y CSS-color mostraron una correlación similar. Por otra parte, la clasificación por color no sería aplicable para cultivares de uva blanca, mientras que en ‘Albariño’ se mantuvo bien la proporcionalidad densidad-CSS. La clasificación por densidades también reflejó el proceso de ablandamiento y que los parámetros relacionados con las dimensiones de la baya apenas muestran correlación con la maduración (datos no mostrados).

Figura 2: Bayas de ‘Tempranillo’ clasificadas empleando una serie de soluciones de NaCl. Ejemplo de clasificación de todas las bayas de un mismo racimo recolectado en torno al 50% de envero. Bayas en los intervalos de densidad: A, 40-60 g NaCl·L^-1; B, 60-80 g NaCl·L^-1; C, 80-100 g NaCl·L^-1; D, 100-120 g NaCl·L^-1. Además de con el observable incremento de superficie coloreada, el aumento de densidad también correlacionó con el incremento en el CSS (aproximadamente, 6º, 9,5º, 13º y 16ºbrix respectivamente, para cada una de las cuatro densidades mostradas). También se observó correlación con el ablandamiento, pero no así con el tamaño y el peso de la baya (datos no mostrados).

En torno a madurez también se da una diversidad de estados fisiológicos de baya y se mantiene la correlación densidad-CSS (datos no mostrados). En este entorno se comparó el transcriptoma de bayas de tres densidades distintas que denominamos premadurez, madurez y sobremadurez en distintos viñedos y años. Los genes diferenciales identificados (FDR< 5% en SAM y con diferencias de expresión > 2-veces) mostraron cambios de expresión progresivos entre las tres densidades (Fig. 3). Las funciones génicas predominantes en cada perfil fueron consistentes entre viñedos, años e incluso cultivares. Así se comprobó la activación de respuestas a estrés y la inactivación del metabolismo de la pared celular y la fotosíntesis con el aumento de densidad y maduración (Fig. 3). Estas funciones génicas son indicativas de un grado de madurez creciente en base a otros trabajos de transcriptómica en la maduración [1,5], de modo que se podría considerar la evaluación de alguno de estos perfiles de expresión como biomarcador del grado de madurez. También se identificaron algunas funciones reguladas específicamente en viñedos o cultivares, como la activación de la síntesis de antocianinas en ‘Tempranillo’ al aumentar la densidad.

Figura 3: Análisis de expresión génica. Se comparó la expresión de tres densidades recolectadas en el momento de madurez técnica en distintos viñedos de ‘Tempranillo’ y ‘Albariño’. A la izquierda se muestran los dos perfiles de expresión típicos identificados entre los genes con diferencias de expresión significativas entre las densidades 120-140, 140-160 y 160-180 g NaCl·L-1 correspondientes a los estados de premadurez, madurez y sobremadurez respectivamente. En los distintos experimentos se observaron resultados similares con alrededor de 800-1.000 genes mostrando diferencias de expresión significativas entre las tres densidades, siendo consistentes los cambios de expresión progresivos entre las mismas, bien de inducción o de represión como se muestra en los perfiles tipo de la figura. A la derecha, cuadro-resumen de las categorías funcionales dominantes, consistente en los distintos viñedos analizados y en los genes reprimidos (arriba) o inducidos (abajo) entre bayas de densidades crecientes.

Como validación del método de muestreo para análisis transcriptómicos, se evaluó la posibilidad de que el protocolo de clasificación de las bayas que utiliza soluciones de NaCl pudiese alterar la expresión génica y si la expresión génica de bayas maduradas en distintas condiciones de cultivo podía responder diferencialmente a la inmersión en NaCl. Esto se comprobó sobre bayas de ‘Tempranillo’ recolectadas entorno al envero, cuyo grado de madurez se fijó seleccionando bayas que presentasen ca. 25% de superficie coloreada. Se comparó la expresión de bayas seleccionadas de este modo sumergidas durante una hora en una solución de alta concentración de NaCl (170 g/L) frente a bayas del mismo tipo no sumergidas. Ningún gen presentó diferencias de expresión significativas entre uvas sumergidas o no sumergidas en NaCl (datos no mostrados). La ausencia de diferencias se observó tanto utilizando bayas procedentes de plantas sometidas a condición de cultivo de riego como cuando se emplearon plantas en situación de no riego, lo cual indica que la inmersión en NaCl no altera significativamente la expresión génica y que tampoco se da una sensibilidad diferencial en bayas procedentes de distintas condiciones de cultivo. En contraste, sí se identificó expresión diferencial en otros ensayos englobados en el proyecto Cenit Deméter, en los que se comparó la expresión de bayas de la misma densidad seleccionadas mediante soluciones de NaCl procedentes de distintas condiciones de cultivo. Estos ensayos apuntan a que distintas condiciones de temperatura sí alteran significativamente la expresión génica. En cambio, situaciones de déficit hídrico alteraron en corta medida la expresión génica de la baya, aunque la clasificación de las densidades evidenció que sí aceleran la maduración sacarimétrica. Este resultado contrasta con diferencias de expresión más acusadas entre bayas de plantas sometidas a condiciones de riego frente a condiciones de no riego en un mismo viñedo, observadas en trabajos que recolectan bayas de los distintos tratamientos al mismo tiempo pero sin emplear ningún sistema para tratar de comparar bayas en el mismo estado de madurez [4]. En este tipo de experimentos probablemente se sobreestiman los efectos directos causados por las diferentes condiciones de cultivo al sumársele las diferencias derivadas de los desplazamientos fenológicos de la maduración.

Agradecimientos

Los resultados presentados fueron obtenidos en el marco de la línea troncal del proyecto Cenit Deméter, financiado por el Centro Tecnológico para el Desarrollo Industrial (CDTI). Agradecemos también la participación de las bodegas colaboradoras: Bodegas Miguel Torres, Bodegas Roda y Bodegas Martín Códax. La hibridación de las micromatrices se llevó a cabo en el servicio de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC).

Referencias bibliográficas

1. Deluc LG, Grimplet J, Wheatley MD, Tillett RL, Quilici DR, et al. (2007) Transcriptomic and metabolite analyses of Cabernet Sauvignon grape berry development. BMC Genomics 8: 429.

2. Pilati S, Perazzolli M, Malossini A, Cestaro A, Dematte L, et al. (2007) Genome-wide transcriptional analysis of grapevine berry ripening reveals a set of genes similarly modulated during three seasons and the occurrence of an oxidative burst at veraison. BMC Genomics 8: 428.

3. Grimplet J, Deluc LG, Tillett RL, Wheatley MD, Schlauch KA, et al. (2007) Tissue-specific mRNA expression profiling in grape berry tissues. BMC Genomics 8: 187.

4. Deluc LG, Quilici DR, Decendit A, Grimplet J, Wheatley MD, et al. (2009) Water deficit alters differentially metabolic pathways affecting important flavor and quality traits in grape berries of Cabernet Sauvignon and Chardonnay. BMC Genomics 10: 212.

5. Lijavetzky D, Carbonell-Bejerano P, Grimplet J, Bravo G, Flores P, et al. (2012) Berry Flesh and Skin Ripening Features in Vitis vinifera as Assessed by Transcriptional Profiling. PLoS One 7: e39547.

6. Jaillon O, Aury JM, Noel B, Policriti A, Clepet C, et al. (2007) The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature 449: 463-467.

7. Pastore C, Zenoni S, Tornielli GB, Allegro G, Dal Santo S, et al. (2011) Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera \1CV\2Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics 12: 631.

8. Dai ZW, Ollat N, Gomes E, Decroocq S, Tandonnet JP, et al. (2011) Ecophysiological, Genetic, and Molecular Causes of Variation in Grape Berry Weight and Composition: A Review. American Journal of Enology and Viticulture 62: 413-425.

9. Keller M (2010) Managing grapevines to optimise fruit development in a challenging environment: a climate change primer for viticulturists. Australian Journal of Grape and Wine Research 16: 56-69.

10. Cozzolino D, Dambergs RG (2009) Wine and beer. In: Sun D-W, editor. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control. Burlington, Mass.: Academic Press. pp. 377-399.

11. Stein U, Blaich R, Wind R (1983) A novel method for non-destructive determination of the sugar content and for classification of grape berries. Vitis 22: 15-22.

12. Fournand D, Vicens A, Sidhoum L, Souquet JM, Moutounet M, et al. (2006) Accumulation and extractability of grape skin tannins and anthocyanins at different advanced physiological stages. J Agric Food Chem 54: 7331-7338.

13. Guillaumie S, Fouquet R, Kappel C, Camps C, Terrier N, et al. (2011) Transcriptional analysis of late ripening stages of grapevine berry. BMC Plant Biol 11: 165.

14. Reid KE, Olsson N, Schlosser J, Peng F, Lund ST (2006) An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development. BMC Plant Biol 6: 27.

15. Grimplet J, Van Hemert J, Carbonell-Bejerano P, Diaz-Riquelme J, Dickerson J, et al. (2012) Comparative analysis of grapevine whole-genome gene predictions, functional annotation, categorization and integration of the predicted gene sequences. BMC Res Notes 5: 213.

16. Lund ST, Peng FY, Nayar T, Reid KE, Schlosser J (2008) Gene expression analyses in individual grape (Vitis vinifera L.) berries during ripening initiation reveal that pigmentation intensity is a valid indicator of developmental staging within the cluster. Plant Mol Biol 68: 301-315.