Vacunación frente a la hemoncosis ovina con la proteína recombinante Hc23
Elshaima Mohamed Fawzi presentó hace unos años una tesis doctoral sobre vacunación frente a la hemoncosis ovina, ante el tribunal correspondiente de la Universidad Complutense de Madrid, que aún es una referencia en el sector.
Las infestaciones por el nematodo gástrico ‘Haemonchus contortus’ provocan importantes pérdidas económicas en rumiantes, de forma especial en ganado ovino. El control de esta enfermedad se ha basado esencialmente en la utilización de antihelmínticos. Sin embargo, suuso indiscriminado, la falta de un diseño estratégico, escasa rotación de fármacos, junto con el desconocimiento de su epidemiología, han provocado la aparición de fenómenos de resistencia antihelmíntica en muchas partes del mundo. La preocupación social por la presencia de residuos con actividad farmacológica en el medio y en los productos cárnicos o lácteos para el consumo; por tanto el empleo de la inmunoprofilaxis es considerado como un sistema alternativo adecuado para el control de esta parasitosis. Se han clonado y expresado numerosos antígenos ocultos (HAGS) de ‘H. contortus’ de potencial interés inmunoprotector; sin embargo, se han realizado pocos esfuerzos para clonar y expresar antígenos naturales (NAGS) que pudieran inducir una respuesta inmunitaria protectora de forma natural durante el transcurso de la infestación.
Algunos antígenos nativos han mostrado ciertos grados de protección contra la hemoncosis pero su eficacia se ha reducido o ha sido nula al utilizar las proteínas recombinantes. La importancia económica de la hemoncosis, las resistencias detectadas en todos los grupos farmacológicos de antihelmínticos y la imposibilidad práctica de las inmunizaciones con proteínas nativas del helminto, ponen de manifiesto la necesidad de utilizar proteínas recombinantes, así como determinar el protocolo de administración más eficaz frente al nematodo. En nuestro estudio nos hemos planteado 1) la purificación y caracterización de la proteína nativa Hc23, que en ensayos previos de vacunación confirió una protección parcial frente a infestaciones con el helminto, 2) la obtención de Hc23 recombinante y 3) la valoración de su capacidad inmunoprofiláctica frente a la hemoncosis experimental de corderos empleando diferentes adyuvantes.
La purificación de la proteína nativa Hc23 se realizó mediante dos métodos diferentes; de una parte, mediante su elución desde la membrana, y en segundo lugar, por cromatografía de inmunoafinidad. El primermétodo de purificación se inició con la sustracción de la Glutation-S-Transferas a (GST) proteína abundante en helmintos adultos, de masa molecular similar, y sin efecto inmunoprotector, que podía interferir en la obtención de la proteína. El resto del extracto se fraccionó en geles de poliacrilamida al 12.5% en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE) y fue electrotransferido a Immobilon P. Las piezas de la membrana que contenían Hc23 se cortaron y se eluyó la proteína unida aunque el rendimiento fue bajo y su obtención laboriosa. Para la purificación de Hc23 mediante el segundo método (inmunoafinidad) se emplearon sueros hiperinmunes policlonales anti rHc23 obtenidos en conejo y purificados con proteína A agarosa y permitieron la purificación de la Hc23 nativa mediante cromatografía de inmunoafinidad. Los resultados obtenidos con este método fueron superiores, con un mayor rendimiento y su obtención fue más rápida.
Para la obtención de la proteína recombinante Hc23 hemos utilizado técnicas de biología molecular (ADN recombinante). Se construyó una biblioteca genómica de cADN de ‘H. contortus’. Tras la obtención de la secuencia completa del gen, el producto amplificado por PCR fue ligado a un vector de clonado. El ADN del plásmido clonado se introdujo en un vector de expresión, con una cola de 6 histidinas, lo que permitió la purificación de la proteína recombinante (rHc23) mediante una columna de Ni-NTA con 100 y 250 mM imidazol. La pureza de la proteína y el rendimiento fueron muy elevados. La proteína mostró un PM aparente ca. 23 KDa [Hc23] tanto en su forma nativa como recombinante; además, en los Western blots se observó una segunda banda de 46 KDa que confirmó su dimerización espontánea, ya que su secuenciación mostró idéntica composición de aminoácidos. La función concreta de la proteína no es conocida. El aminoácido N-terminal de la secuencia fue Metionina (Met), lo que indicó la obtención de la proteína completa. Ambas formas de Hc23, nativa y recombinante fueron empleadas en los ensayos de inmunización frente a la hemoncosis ovina.
En el ensayo vacunal se emplearon 48 corderos de raza Assaf de 4-5 meses de edad; los animales fueron separados de forma estratificada en 6 lotes de 7 corderos sometidos diversos tratamientos, y 1 lote de 6 animales que actuaron como testigos del experimento. El grupo I fue inmunizado con la proteína nativa Hc23 (Hc23) de ‘H. contortus’ en Hidróxido de aluminio, 3 veces, cada 2 semanas, y 2 semanas después de la última dosis fue sometido a una infestación (reto) con 15000 L3 del parásito. El grupo II siguió el mismo protocolo de inmunización e infestación pero utilizando la proteína recombinante rHc23. El grupo III recibió una primera dosis de la proteína nativa en una solución adyuvante que contenía lipopolisacáridos de ‘E. coli’ y ‘Propionibacterium spp.’, 2 días después se repitió la misma inoculación y se procedió a la infestación de los animales; para finalizar, una semana más tarde recibieron una dosis inmunizante de recuerdo que se repitió a la semana siguiente. En el grupo IV se realizó el mismo protocolo de inmunización e infestación del grupo III, pero empleando proteína recombinante. El grupo V fue el grupo testigo negativo. El grupo VI fue el grupo testigo positivo de la infestación. El grupo VII (con 4 meses y medio de edad) fue primoinfestado con 10000 L3 de ‘H. contortus’; dicha infestación se terminó el día 35 postinfestación tras un tratamiento antihelmíntico, y 2 semanas más tarde se llevó a cabo la reinfestación (reto) de los animales. El reto parasitario se mantuvo en todos los grupos durante 45 días, para finalmente proceder al sacrificio de los animales.
La inmunización indujo una protección parcial frente a la hemoncosis experimental en los corderos vacunados, donde todos los grupos vacunados, tanto con Hc23 nativa como Hc23 recombinante, mostraron una reducción significativa en la eliminación fecal de huevos, de un 57% en GI, 74% en GII y del 79% en GIII y GIV respecto al grupo primoinfestado (GVI); además de una disminución en la carga parasitaria, desde el 69% para el GI hasta más del 85% para los otros 3 grupos (GII, GIII y GIV). Asimismo, los animales inmunizados mostraron pérdidas sanguíneas inferiores, con valores del hematocrito superiores a los determinados en el grupo primoinfestado. La respuesta eosinofílica periférica guardó relación con el protocolo de inmunización empleado con cada adyuvante, con una notable respuesta de anticuerpos específicos. Los animales del grupo GVII mostraron una reducción de los recuentos de huevos y de la carga parasitaria respecto algrupo GVI; sin embargo, no se apreciaron diferencias significativas con los grupos vacunados.
La protección inducida redujo la carga parasitaria de los corderos y minimizó el efecto patógeno más notable del helminto. La reducción de la eliminación fecal de huevos de ‘H. contortus’ evitó los niveles elevados de huevos en el medio, reduciendo de esta forma el nivel de riesgo ambiental. Por ello, la utilización de Hc23 con ambos adyuvantes empleados puede constituir una herramienta útil de control inmunoprofiláctico de la hemoncosis. La actividad de la proteína recombinante (rHc23) apunta a su interés como candidato para su desarrollo industrial.
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