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'C. cladosporioides' otorgó la mejor protección y redujo el tamaño de las lesiones en más del 91%

Hongos saprófitos como herramientas de control biológico de ‘Botrytis cinerea’ en tomate

Gustavo M. Dal Bello; Andrés I. Nico; Cecilia I. Mónaco (CIDEFI y Cátedra de Horticultura, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires, Argentina)17/07/2012
El hongo ‘Botrytis cinerea’ es un importante patógeno de plantas cultivadas. Ha sido citado sobre más de 200 especies vegetales y puede provocar enfermedades desde el estado de plántula hasta la poscosecha. Según una encuesta reciente, los especialistas lo ubican en segundo lugar en importancia entre todos los hongos fitopatógenos conocidos (Dean et al., 2012). La enfermedad asociada a ‘B. cinerea’ suele conocerse con el nombre genérico de podredumbre gris, denominación que remite al signo típico con que se manifiesta.
En el tomate, su presencia puede verificarse en localizaciones muy diversas de la parte aérea de la planta causando sintomatologías de variada naturaleza (Dick y Elad 1999). En efecto, durante el cultivo de tomate ‘B. cinerea’ puede provocar cancro del tallo y podredumbre de hojas, flores y frutos recién cuajados. Los frutos maduros también pueden ser infectados en almacén, ya que ‘B. cinerea’ es un importante patógeno de poscosecha (Fig. 1).
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Figura 1: Podredumbre gris ocasionada por Botrytis cinerea sobre frutos de tomate.

Para el control de ‘B. cinerea’ se recurre principalmente al empleo de fungicidas. Estos productos de síntesis han sido utilizados con éxito durante largo tiempo, pero al día de hoy los agricultores comprueban controles insuficientes que responden a una alta versatilidad genética del patógeno. (Williamson et al. 2007). ‘B. cinerea’ ha desarrollado en un tiempo relativamente corto resistencia a fungicidas de grupos químicos diferentes como las dicarboximidas, los benzimidazoles, el dietofencarb y los inhibidores de la síntesis del esterol (Yunis y Elad 1989; Gullino 1992; O’Neill et al., 1996; Lamondia y Douglas 1997). Por otra parte, los productos disponibles se enfrentan cada vez más a la sostenida revisión y revocación de sus usos autorizados y a la vez despiertan una creciente inquietud social por los problemas ambientales asociados a su uso (Greer y Diver 1999).

Esta preocupación se vuelve extrema, por otra parte, si consideramos que los fungicidas empleados en el control de enfermedades de poscosecha se aplican sobre un artículo listo para su consumo inmediato (Roberts, 1990). Por este motivo en los últimos años se ha intensificado la prospección de alternativas inocuas que permitiesen controlar las enfermedades de poscosecha asociadas a ‘B. cinerea’. Cabe mencionar, en este sentido, experiencias tales como el uso de tratamientos térmicos (Fallik et al., 1993), la inmersión en soluciones de bicarbonato potásico (Bombelli y Wright, 2006) o lejía (Mahovic et al., 2004), y el empleo de agentes de control biológico (Mari et al., 1996; Kalogiannis et al., 2006). Durante los últimos veinticinco años han sido identificados múltiples microorganismos de alta efectividad contra ‘B. cinerea’ (Janisiewicz 1988; Helbig 2002) y la eficacia de los mismos como herramienta alternativa o suplementaria al control químico ha sido ensayada (Köhl et al., 1995; Janisiewicz y Korsten, 2002).

En el CIDEFI (Centro de Investigaciones de Fitopatología) iniciamos hace aproximadamente diez años investigaciones destinadas a seleccionar antagonistas eficaces para el control biológico de ‘B. cinerea’ sobre tomate en poscosecha. Los primeros trabajos se concentraron en seleccionar dichos antagonistas entre diferentes aislados de levaduras provenientes de biofilms de solanáceas espontáneas y cultivadas. Las levaduras son antagonistas particularmente apropiados para su empleo en poscosecha debido a su alta capacidad inhibitoria, la rápida colonización de las heridas y por su modo de acción basado principalmente en la competencia por nutrientes, interacción física directa con las hifas del patógeno y producción de enzimas activas sobre los componentes de la pared celular (Droby y Chalutz, 1994; Castoria et al., 1997). Con posterioridad, la prospección de antagonistas entre los habitantes de la micoflora de los biofilms se hizo extensiva a los hongos filamentosos. Las investigaciones permitieron hallar antagonistas de comportamiento promisorio tanto en este grupo, como dentro de las levaduras (Dal Bello et al., 2008; Mónaco et al., 2009). En el presente artículo se describen los aspectos más relevantes de estos trabajos, expuestos en el Congreso Internacional de Poscosecha de Lleida.

Metodología

Se relata a continuación la metodología empleada en dos ensayos individuales de control biológico. En el primero de ellos se evaluaron como antagonistas diferentes levaduras, mientras que en el segundo los agentes de control biológico empleados fueron distintos hongos filamentosos. En todos los experimentos se empleó una cepa del patógeno ‘Botrytis cinerea’ (Bc11) aislada previamente de frutos infectados. El hongo se mantuvo en cultivo puro en medio artificial (agar patata dextrosa) y se recurrió al mismo cada vez que fue necesario contar con inóculo para los sucesivos ensayos.

La selección de las levaduras evaluadas en el primer ensayo se efectuó entre 300 cepas diferentes previamente aisladas del filoplano de distintas plantas solanáceas recolectadas en el área del cinturón hortícola de La Plata, Argentina. En esta recolección se privilegiaron ambientes que no hubieran estado sometidos a programas de aplicación de fungicidas y que por lo tanto contaran previsiblemente con micofloras de mayor diversidad. Para el aislamiento se recurrió a la agitación de trozos de hojas y flores en agua destilada estéril, la dilución progresiva logarítmica de la suspensión y la posterior siembra en placas de Petri con medio de cultivo específico para levaduras (NYDA, Zhang et al., 2004).

A fin de efectuar una primera selección in vitro entre las levaduras se recurrió a la técnica del cultivo dual (Fig. 2). Para realizar el mismo se sembró sobre una placa de Petri conteniendo PDA un disco de agar de un cultivo de ‘B. cinerea’ en activo crecimiento y transcurridas 24 horas en el extremo opuesto se inoculó la levadura correspondiente sobre la placa mediante la técnica de siembra en estrías. Al cabo de cinco días de incubación el porcentaje de inhibición en el crecimiento diametral de las colonias de ‘B. cinerea’, así como el ancho de la zona de inhibición fueron evaluados y comparados con un testigo.

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Figura 2: Técnica de cultivo dual mostrando la interacción entre 'Botrytis cinerea' y 'Candida pelliculosa'.
Las cepas que mostraron mejor comportamiento en el cultivo dual fueron evaluadas posteriormente en su capacidad de inhibir la germinación de las esporas del patógeno. Para efectuar este ensayo se obtuvo, por un lado, una suspensión de conidias de ‘B. cinerea’ y, por otra parte, una suspensión de células de la levadura. La concentración de las suspensiones fue ajustada hasta las 107 ufc/μl en el caso del antagonista, y las 105 conidias/μl, en el caso de ‘B. cinerea’. Ambas suspensiones fueron mezcladas y pequeños volúmenes de la mezcla fueron transferidos a portaobjetos estériles que se incubaron bajo cámara húmeda durante 24 h a 25 °C. Al cabo de la incubación los portaobjetos fueron observados bajo microscopio y se evaluó el porcentaje de conidias del hongo que habían germinado. Las cepas que mostraron en las pruebas in vitro mejor actividad inhibidora sobre ‘B. cinerea’ fueron escogidas para las posteriores pruebas in vivo.

Las pruebas in vivo se realizaron sobre frutos de tomate Dominique F1 (Hazera Genetics Ltd., Israel) que habían sido mantenidos en almacenamiento a 4 °C durante una semana antes del experimento. Los frutos se esterilizaron superficialmente por inmersión en suspensión de lejía durante 15 min, seguida de lavado con agua destilada estéril y secado bajo cámara de flujo. Sobre los tomates preparados de este modo se efectuaron tres heridas de 4 mm de profundidad sobre la región ecuatorial con una aguja estéril. Inmediatamente después sobre cada una de las heridas se aplicó un pequeño disco de papel de filtro estéril embebido en una suspensión acuosa de la levadura correspondiente. Se dejó secar la suspensión sobre la herida durante 30 m a temperatura ambiente y posteriormente encima del disco conteniendo las levaduras se colocó otro de igual diámetro embebido en una suspensión de conidias de ‘B. cinerea’. Se dispusieron sendos testigos –uno solo con ‘B. cinerea’ y otro solo con levaduras– y los frutos se mantuvieron en incubación en cámara húmeda durante siete días a 20 °C. La severidad de los síntomas fue evaluada posteriormente siguiendo una escala diseñada en función del diámetro de las lesiones.

En el segundo de los ensayos que se relata en este trabajo la selección de antagonistas estuvo dirigida a hongos filamentosos. Para ello se efectuaron aislamientos de cepas presentes en filo y fructoplano de tomates cultivados bajo invernaderos comerciales del área hortícola circundante a la ciudad de La Plata. La preselección in vitro se realizó sobre 222 aislados recurriendo a la técnica del cultivo dual. Esto permitió escoger 38 cepas que fueron empleadas en la segunda etapa de ensayo in vivo, efectuada recurriendo a la técnica oportunamente mencionada para el ensayo de las levaduras (Fig. 3). En esta ocasión el ensayo se efectuó sobre frutos de tomate Superman F1 (Seminis Vegetable Seeds, Inc., USA).

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Figura 3: Bioensayo de control de ‘Botrytis cinerea’ sobre frutos de tomate con hongos filamentosos antagonistas.

Resultados

Entre todas las levaduras aisladas en la prospección se escogieron, para las pruebas posteriores, 14 cepas que mostraron una fuerte actividad antagonista en el cultivo dual (crecimiento diametral inferior en 30 a 50 % al registrado en el control; zona de inhibición superior a 5 mm). Los organismos fueron identificados como cepas de Rodothorula rubra y Candida pelliculosa (Tabla 1).
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Tabla 1: Levaduras seleccionadas y empleadas en el experimento.
Estas cepas mostraron del mismo modo un buen comportamiento en el test de inhibición de germinación de esporas, en todos los casos superior al 40% respecto al control (Figs. 4 y 5).
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Figura 4: Efecto de una levadura aislada de filoplano sobre la germinación de conidias de ‘Botrytis cinerea’ (derecha) y control (izquierda).
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Figura 5: Efecto de las levaduras seleccionadas sobre la germinación de esporas de ‘Botrytis cinerea’. Las barras de datos que comparten la misma letra no difieren significativamente entre sí, según el test de diferencias mínimas significativas (P < 0.05).
En la prueba in vivo los diferentes aislados evaluados difirieron manifiestamente en su capacidad de reducir el desarrollo de las lesiones provocadas por 'B. cinerea'. Doce de las 14 cepas evaluadas redujeron de un 55 a 100% la incidencia del moho gris y de un 30 a 70% su incidencia respecto del testigo. Las cepas 231, 230, 214, 223, 145, 220, 15, 218, 215, 201, 151 y 210, por otra parte, redujeron significativamente el diámetro de las lesiones en comparación con los testigos no tratados con levaduras (Fig. 6). El máximo control de la podredumbre por moho gris se obtuvo con las cepas 231 y 230 de 'R. rubra', que redujeron el desarrollo de las lesiones en más de un 90%. Las cepas 164 y 209 no produjeron reducción significativa en los síntomas de la podredumbre mostrándose, por consiguiente, totalmente ineficaces para el control.
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Figura 6: Actividad de 14 aislados de levaduras sobre la severidad de la enfermedad provocada por Botrytis cinerea sobre frutos de tomate. Las barras de datos que comparten la misma letra no difieren significativamente entre sí según el test de diferencias mínimas significativas (P < 0.05).
En el experimento de supresión de 'B. cinerea' mediante el empleo de hongos filamentosos se seleccionaron, en la primera instancia de evaluación mediante cultivo dual, 38 aislados que mostraron reducir el crecimiento cultural del patógeno en más del 50% (Fig. 7). Estos aislados fueron evaluados en la segunda etapa in vivo. En esta ocasión 7 aislados de 'Cladosporium cladosporioides', 'Trichoderma harzianum', 'Penicillium sp' y 'Alternaria alternata' mostraron ser significativamente eficaces en el control, ya que redujeron el diámetro de las lesiones en más de un 50% con respecto al testigo inoculado con el patógeno y sin aplicación de antagonistas. 'C. cladosporioides' otorgó la mejor protección y redujo el tamaño de las lesiones en más del 91%.
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Figura 7: Cultivo dual de ‘T. harzianum’ y ‘Botrytis. Cinerea’.
Referencias bibliográficas

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