Un método para el control de calidad e identificación rápida del hongo Trichoderma harzianum en sus productos

Nueva cepa de Trichoderma harzianum

A. Martinez-Murcia,B. Pérez Martí01/06/2004

La empresa Investigaciones y Aplicaciones Biotecnológicas S. L. pone a punto con la colaboración de la Unidad de Diagnóstico Molecular de la Universidad Miguel Hernández un nuevo método para el control de calidad e identificación rápida del hongo Trichoderma harzianum en sus productos.

Entre los hongos utilizados para el biocontrol de patógenos fúngicos del suelo, las especies de Trichoderma merecen una mayor atención. Los Trichoderma viven en asociación con plantas a las que protegen de la actividad de diversos hongos patógenos por diferentes caminos lo que complica el conocer en profundidad su forma de actuar.

Actuando como mycoparásitos (Harman, 2000), produciendo enzimas que degradan las paredes celulares de las hifas y esclerocios del patógeno a la vez que excretan metabolitos con actividad antibiótica que inhiben el crecimiento de dichos hongos patógenos.

También actúan por mecanismos de competencia. Así, cuando entran en contacto con las raíces, las van cubriendo con su micelio, avanzando a medida que aquellas crecen y formando una barrera que las protege de la actividad de ciertos hongos patógenos.    Su importancia ha llegado hasta el punto de insertar los genes de este hongo en plantas para proveerlas de resistencia a diversas enfermedades (Lorito et al. 1998).

El tipado de cepas cobra especial relevancia en la agricultura al poder hacer seguimientos de cepas registradas. Debido al extenso número de cepas descritas de Trichoderma harzianum, es fundamental el uso de estas técnicas para la identificación de nuevas variedades o cepas y para el control de calidad de los productos de nuestra empresa.

Las técnicas genéticas utilizadas en la identificación de especies y géneros de hongos incluyen, entre otras, el análisis de polimorfismo del ADN amplificado con cebadores arbitrarios (RAPD).

La técnica RAPD se basa en la amplificación simultánea de múltiples fragmentos de ADN nuclear mediante PCR, utilizando un único cebador de secuencia aleatoria y bajo peso molecular que, a muy baja temperatura, hibrida con la molécula de DNA en diferentes posiciones. Los fragmentos se analizan mediante electroforesis, obteniéndose un patrón genético ("fingerprinting") característico para cada organismo, ya que el número y tamaño de los fragmentos amplificados a partir de determinado ADN mediante RAPD se mantiene constante siempre que se use el mismo cebador y se haga el estudio en las mismas condiciones. Los perfiles obtenidos permitin la diferenciación de ADNs a nivel de especie o incluso de individuo (Boekhout et al., 1998, Reiss et al. 1998, Roberts et al., 1992)

Métodos
Identificación de especie: El DNA total extraído de un cultivo puro fue sometido a experimentos de identificación genetica. El gen rDNA 16s se amplificó por PCR y se secuenció casi en su totalidad (unas 1500 pb). Por comparación con bases de datos se llegó a la conclusión de que se trata de Trichoderma harzianum

Tipado de las cepas: A partir del producto Tripromoter se creció Trichoderma harzianum en placas "rosa de bengala agar" para la obtención de biomasa fúngica, tras lo que se realizó la extracción y purificación del DNA mediante un protocolo optimizado para hongos. El tipado de las cepas se realizó mediante la técnica molecular RAPD.

Se llevaron a cabo experimentos para la puesta a punto de las condiciones apropiadas para la reacción de RAPD, así como numerosas pruebas con varios cebadores diferentes para conseguir los que presentaran mayor polimorfismo y fuesen capaces de diferenciar mejor entre cepas. Finalmente se seleccionó el cebador TH2 para realizar el tipado genético de T. harzianum.

Resultados y Conclusiones
Mediante la tipificación a través de RAPD del Tripromoter de I.A.B., se pone de manifiesto que la cepa es la misma en todos los lotes y diferente de las cuatro cepas de Trichoderma harzianum de referencia. Aislados de suelo recolectado, fueron identificados como Trichoderma harzianum mediante secuenciación del gen rDNA 16s.

El tipado genético garantiza la autenticidad de las cepas utilizadas en diferentes productos, así como la calidad de los mismos. Además de la verificación  y autenticidad de la cepa utilizada en los diferentes productos, el trabajo ha permitido poner a punto un método de tipado "inequívoco" de gran utilidad para el control de calidad microbiológico de estos fungicidas.

Los métodos convencionales basados en técnicas de cultivo presentan varios problemas que los hacen  menos útiles en la cadena de producción:

- Las reacciones bioquímicas son altamente variables, lo que impide la identificación  exacta y segura de una cepa.

- Los resultados tardan días y para entonces ha finalizado la fermentación en la línea de producción, lo cual supone un riesgo elevado de pérdidas en la producción.

Este método ofrece a I.A.B. resultados inequívocos, identificando a nivel de cepa el microorganismo utilizado en la fermentación. Así controla con garantía la identidad del microorganismo en todo el proceso de producción, asegurando que el producto final contiene sólo la cepa con la que se inició la producción, evitando o detectando rápido posibles contaminaciones por otros microorganismos.

El análisis molecular permite detectar la cepa en otros productos similares. Además, se pueden aislar y comparar cepas del microorganismo  tras su uso en el campo, verificando si se trata de la misma cepa que la usada en el proceso industrial y evaluar su viabilidad en el medio ambiente.

El análisis molecular de los productos envasados de I.A.B. confirmará su calidad y homogeneidad en la cadena de producción. Otros argumentos que aportan valor comercial añadido son: certificación de la calidad del producto; control y rendimiento de la producción, evaluación de su efectividad y análisis microbiológico fiable y rápido.

Bibliografía:

- Boekhout T., Kamp M., Guëhot E., 1998. Molecular typing of Malassezia species with PFGE and RAPD. Medical Mycology, 36: 429-432
- Harman G. E., 2000: The myths and dogmas of biocontrol. Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum strain T-22. Plant disease 84(4):377-393.
- Lorito M., Woo S. L., Garcia Fernandez I., Colucci G., Harman G. E., Pintor-toro J. A., Filippone E., Mucciflora S., Lawrence C. B., Zoina A., Tuzun S., Scala F., 1998. Genes from mycoparasitic fungi as a source for improving plant resistance to fungal pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95: 7860-7865.
- Reiss E., Tanaka K., Bruker G., et al., 1998. Molecular diagnosis and epidemiology of fungal infections. J. Med. Mycol., 36: 249-257.
- Roberts G. D., Pfaller M. A., Gueho E., et al., 1992. Developments in the diagnostic mycology laboratory. Journal of Medical and Veterinary Mycology, 30 supplement 1. 241-248

Para más información: ammurcia@umh.es y perez@iabiotec.com

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