Los resultados obtenidos mostraron que la aplicación de determinados factores de estrés de tipo abiótico y biótico puede aumentar la concentración de compuestos fitoquímicos bioactivos

Incremento de compuestos fitoquímicos bioactivos en brotes de brócoli mediante tratamientos inductores de estrés

Santiago Pérez Balibrea (Autor), Cristina García Viguera y Diego A. Moreno Fernández (Directores de tesis)

Dpto. Ciencia y Tecnología de Alimentos, CEBAS-CSIC (Murcia)

23/03/2011

23 de marzo de 2011

Los brotes o germinados de brócoli (Brassica oleracea var. italica) representan una excelente fuente de compuestos fitoquímicos con elevadas concentraciones de vitaminas, flavonoides, ácidos hidroxicinámicos y glucosinolatos (Traka y Mithen, 2009). Estos compuestos bioactivos del brócoli, ejercen un importante papel en la prevención de enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, reduciendo también la incidencia de diversos tipos de cáncer (Jeffery y Araya, 2009). El consumo regular de brotes de brócoli, debido a sus propiedades fitoquímicas y a que la ingesta de éstos se realiza en su matriz natural, aumenta la biodisponibilidad de los compuestos bioactivos, estimulando los mecanismos defensa del organismo de forma más eficiente que las inflorescencias comerciales de brócoli (Fahey et al., 1997).
Determinadas condiciones de estrés, que pueda sufrir el vegetal durante su etapa de desarrollo, inducen una serie de respuestas fisiológicas que influyen en el metabolismo primario y secundario del vegetal, activando diversos factores de transcripción e induciendo la expresión de genes implicados en la defensa vegetal (Jahangir et al., 2009), los cuales implican modificaciones de las rutas biosintéticas conllevando un aumento de metabolitos secundarios endógenos, favoreciendo la acumulación de compuestos antioxidantes (Zhao et al., 2005). Por lo tanto, el principal objetivo de la tesis doctoral fue obtener brotes de brócoli enriquecidos en compuestos bioactivos mediante la aplicación de condiciones de estrés, con el fin de conseguir un alimento natural, con un valor nutricional añadido que ejerza una acción fisiológica más eficiente en la salud del consumidor.

Metodología general

Semillas de diversos cultivares de brócoli fueron prehidratadas en aireación durante 12 horas, tras lo cual fueron sembradas en bandejas con sustrato inerte y germinadas en una cámara de crecimiento controlado (fotoperiodo 16 h/8 h luz/oscuridad; temperatura aire, 25 °C/20 °C; humedad relativa 60%/80%). En cada una de las experiencias se realizaron muestreos de material vegetal a día cero (semillas) y a lo largo de la fase de germinación de los brotes. Tras los diversos muestreos, el material vegetal fue pesado, congelado a -80 °C, liofilizado y posteriormente molido para realizar las determinaciones analíticas de compuestos fitoquímicos. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

El contenido en vitamina C se determinó mediante la suma del contenido en ácido ascórbico (AA) y ácido dehidroascórbico (DHAA). Los análisis por HPLC-UV de la vitamina C (AA + DHAA) se llevaron a cabo después de la derivatización del DHAA al fluoróforo 3-(1,2-dihidroxietil)furo(3,4-b) quinoxalina-1-ona (DFQ) con 1,2-ortofenilendiamina (OPDA; Fluka Chemika, Neu-Ulm, Suiza), según método de Pérez-Balibrea et al (2008).

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Semillas de diversos cultivares de brócoli fueron prehidratadas en aireación durante 12 horas.
Para la determinación de la capacidad antioxidante se utilizaron técnicas basadas en medidas espectrofotométricas, mediante los ensayos DPPH· y ABTS·+
La concentración de glucosinolatos y compuestos fenólicos se determinó mediante HPLC-DAD. Para la extracción, a las muestras de material vegetal liofilizado y molido (50 mg) se le añadieron 1,5 ml de medio de extracción metanol:agua (7:3, v:v). La extracción se realizó en un baño a 70 °C durante 30 minutos con el fin de desnaturalizar el enzima mirosinasa y evitar así la hidrólisis de los glucosinolatos, agitando cada 5 min con un agitador Vortex. para su análisis por HPLC-DAD (Pérez- Balibrea et al, 2010).

Los glucosinolatos fueron registrados a 227 nm y se identificaron con el método anteriormente descrito de glucosinolatos intactos LC-MS (Bennet et al., 2004) y cuantificados por HPLC-DAD utilizando sinigrina (Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Steinheim, Alemania) como estándar externo. Para los compuestos fenólicos, los cromatogramas se determinaron, analizaron y midieron a 280, 320 y 360 nm. Los derivados del ácido caféico se cuantificaron como ácido clorogénico (ácido 5-caffeoilquinico, Sigma, St. Louis, EEUU), los flavonoides como rutina (quercetina 3-rutinosido, Sigma, St. Louis, EEUU) y los derivados del ácido sinápico como ácido sinápico (Sigma, St. Louis, EEUU).

Para la determinación de la capacidad antioxidante se utilizaron técnicas basadas en medidas espectrofotométricas, mediante los ensayos DPPH· y ABTS·+, usando los radicales 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH·) (Brand-William et al., 1995) y el catión radical 2,2´-azinobis (3-etilbenzoatotiazolín-6-sulfonato) (ABTS·+) (Espín et al., 2000).

El análisis de la varianza (Anova) se realizó a un nivel de significación de P≤ 0,05 mediante el programa estadístico SPSS 14.0 (Chicago, EEUU). La comparación entre valores medios según tratamientos se realizó por el  Test de Rangos Múltiples de Duncan (*P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001).

Resumen de los resultados

Los experimentos realizados en la tesis doctoral se centraron en la evaluación de distintas estrategias para obtener brotes de brócoli con un elevado contenido en compuestos bioactivos beneficiosos para la salud, pudiendo ser consumidos como vegetales en la dieta, como constituyentes de alimentos funcionales o como suplementos dietéticos. Asimismo, también se determinó la influencia del genotipo y de las condiciones de envasado y almacenamiento en la calidad y composición de los brotes de brócoli. A continuación se exponen de forma resumida los resultados más significativos obtenidos tras los distintos estudios.

Efecto del genotipo en la calidad fitoquímica de semillas y brotes de distintos cultivares comerciales de brócoli

En este estudio (Pérez-Balibrea et al., 2011a) se determinó la influencia del genotipo en el contenido de compuestos nitrógeno-sulforados (glucosinolatos) y antioxidantes naturales (compuestos fenólicos y vitamina C) en semillas y brotes de brócoli (Brassica oleracea var. italica) de los cultivares ‘Nubia’, ‘Marathon’ y ‘Viola’. El desarrollo de los brotes favoreció la biosíntesis de vitamina C. Entre cultivares, el contenido de vitamina C fue significativamente mayor en brotes de ‘Marathon’ (38 – 65 mg 100 g-1 peso fresco) y ‘Viola’ (36 – 62 mg 100 g-1 pf) que en ‘Nubia’ (28 – 54 mg 100 g-1 pf).

Respecto al contenido fenólico total, las semillas y brotes del cultivar ‘Viola’ fueron significativamente más ricos (640, 228 y 224 mg 100 g-1 pf, en brotes de 3, 7 y 14 días, respectivamente) que ‘Nubia’ y ‘Marathon’. También se determinaron diferencias significativas a nivel de glucosinolatos individuales y totales. En el caso de los glucosinolatos alifáticos, mas afectados por factores genéticos (Moreno et al., 2008), ‘Nubia’ y ‘Marathon’ fueron un 64% mas ricos en glucorafanina (precursor del isotiocianato sulforafano) que ‘Viola’. Los brotes de 3 días de ‘Marathon’ presentaron las mayores concentraciones de glucosinolatos totales y glucorafanina (556 y 204 mg 100 g-1 pf, respectivamente), sin embargo, al final del periodo estudiado (14 días) fueron los brotes de ‘Viola’ los que registraron la mayor concentración de glucosinolatos totales (208 mg 100 g-1 pf).

El estudio comparativo de cultivares comerciales indicó que, si bien los brotes de brócoli representan una fuente importante de fitoquímicos, las particularidades genéticas de las semillas dan lugar a diferencias cuantitativas y cualitativas considerables, afectando decisivamente a la calidad nutritiva de los brotes de brócoli.

El análisis de antocianos mediante HPLC/UV-PAD/ESI-MS/MS resultó una herramienta útil para la diferenciación cualitativa de los brotes así como para la cuantificación de derivados de cianidina, caracterizados por primera vez en brotes de brócoli

Indetificación de antocianos acilados en brotes de brócoli

La caracterización, mediante HPLC/UV-PAD/ESI-MS/MS, de antocianos acilados en brotes de brócoli de los cultivares ‘Marathon’, ‘Nubia’, ‘Viola’, y en brotes de semillas destinadas a la producción comercial de brotes (‘Intersemillas’) reveló como principal compuesto la cianidina 3-O-diglucosido-5-O-glucosido mono o diacilada, dando lugar a los isomeros de cianidina 3-O-(acil)diglucosido-5-O-glucosido, cianidina 3-O-(acil1)(acil2)diglucosido-5-O-glucosido, y cianidina 3-O-(acil1)(acil2)diglucosido-5-O-(malonil)glucosido (Moreno et al., 2010).

Los brotes del cultivar ‘Viola’ presentaron concentraciones significativamente superiores de cianidina 3-O-(sinapoil)diglucosido-5-O-glucosido, cianidina 3-O-(feruloil)diglucosido-5-O-glucosido, cianidina 3-O-(sinapoil)(sinapoil)diglucosido-5-O-glucosido y cianidina 3-O-(sinapoil)(feruloil)diglucosido-5-O-(malonil)glucosido. La concentración total de antocianinas identificadas en los brotes ‘Marathon’, ‘Nubia’ e ‘Intersemillas’ fue similar (0,23 – 0,29 mg 100 g-1 pf) y significativamente menor que la determinada en los brotes ‘Viola’ (0,64 mg 100 g-1 pf).

El análisis de antocianos mediante HPLC/UV-PAD/ESI-MS/MS resultó una herramienta útil para la diferenciación cualitativa de los brotes así como para la cuantificación de derivados de cianidina, caracterizados por primera vez en brotes de brócoli.

Efecto del régimen lumínico sobre los compuestos fitoquímicos bioactivos de los brotes de brócoli

También se determinó la influencia de distintos regímenes lumínicos, aplicados durante la germinación, sobre la acumulación de compuestos bioactivos en brotes de brócoli, así como su distribución relativa entre los distintos órganos (radícula, hipocotilo y cotiledón) en dichas condiciones (Pérez-Balibrea et al., 2008).

Se observó una influencia positiva y significativa de las condiciones lumínicas en el contenido fitoquímico ya que los brotes de brócoli germinados con luz registraron un 83% más de vitamina C, un 33% más de glucosinolatos, y un 62% más de compuestos fenólicos por cada 100 gramos de peso fresco, que los brotes germinados en oscuridad.

La distribución relativa y porcentual entre órganos fue muy similar en las distintas condiciones de germinación, representando la parte comestible del brote (hipocotilo y cotiledón) más del 90% del contenido fitoquímico, debido principalmente a las elevadas concentraciones presentes en los cotiledones. En condiciones de luz el contenido en vitamina C de los cotiledones representó el 63% de la concentración presente en los brotes, sin embargo en condiciones de oscuridad la distribución porcentual de vitamina C representó el 37% tras 14 días de germinación, observándose además una redistribución de la vitamina C en los brotes germinados en ausencia de luz.

La biosíntesis y acumulación de compuestos antioxidantes (vitamina C) y fitoalexinas (flavonoides y glucosinolatos) se vio significativamente favorecida tras la germinación en condiciones de luz. La radiación lumínica favoreció la acumulación de flavonoides ya que estos se inducen, a través de la ruta de los fenilpropanoides, como respuesta a altos niveles de luz visible y ultravioleta debido a su papel fotoprotector (Ververidis et al., 2007). Por tanto, el control del régimen lumínico es una herramienta útil para mejorar la calidad nutricional de los brotes de brócoli, siendo recomendable la exposición de las semillas a elevados niveles de luz desde el inicio de la germinación.
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Efecto de la fertilización con azufre sobre el contenido en glucosinolatos de los brotes de brócoli

El azufre (S), como constituyente de los aminoácidos metionina y cisteína está directamente implicado en la biosíntesis de los glucosinolatos, por lo que se determinó el efecto de la aplicación de éste elemento mineral en la concentración y acumulación de glucosinolatos en brotes de brócoli (Pérez-Balibrea et al., 2010).

La concentración de glucosinolatos se vio afectada por las distintas dosis de azufre aplicadas ya que los tratamientos S15 (15 mg L-1 K2SO4), S30 y S60 consiguieron aumentar la concentración total de glucosinolatos en un 14, 18 y 23%, respectivamente, con respecto a los brotes no tratados (S0) tras 12 días de germinación y tratamiento. Los glucosinolatos alifáticos, derivados del aminoácido metionina, fueron los más afectados por las dosis de azufre aplicadas, por el contrario, los glucosinolatos indólicos, derivados del triptófano, no se vieron afectados por el tratamiento.

Los datos obtenidos mostraron que, si bien el grado de desarrollo del brote fue el factor más determinante en la concentración de glucosinolatos, la aplicación y una óptima asimilación de azufre favorece la biosíntesis y acumulación de glucosinolatos alifáticos en los brotes de brócoli después de 12 días de tratamiento y germinación.

Acumulación de compuestos fitoquímicos en brotes de brócoli mediante la aplicación de elicitadores

Determinados inductores del metabolismo secundario (elicitadores) provocan la activación de mecanismos de defensa frente al estrés y dan lugar la síntesis de compuestos antioxidantes y acumulación de fitoalexinas (Zhao et al., 2005). Para mejorar los niveles de fitoquímicos bioactivos de los brotes de brócoli se llevo a cabo el estudio del efecto de la aplicación foliar de metionina, triptófano, chitosan, ácido salicílico (SA) y metil jasmonato (MeJA) durante el periodo de germinación (Pérez-Balibrea et al., 2011b).

Los tratamientos con 200 µM y 300 µM SA, así como chitosano al 0,01% provocaron incrementos positivos y significativos, de un 26, 18 y 54% respectivamente en el contenido de vitamina C de los brotes de brócoli de 5 días. También la concentración de flavonoides aumentó un 33 y un 31% tras la aplicación de 100 µM SA y 10 µM MeJA, respectivamente, tras 7 días de tratamiento. Por el contrario, la aplicación de los aminoácidos metionina y triptófano no causó un aumento del contenido de vitamina C ni de compuestos fenólicos.

Además, las distintas clases de glucosinolatos respondieron de forma deferente a los tratamientos inductores estudiados. La aplicación foliar de 5 mM del aminoácido precursor metionina provocó un aumento significativo del 32% en los niveles de glucosinolatos alifáticos. Sin embargo, los glucosinolatos indólicos fueron más sensibles a los tratamientos con triptófano, SA y MeJA, ya que, en brotes de 7 días, la concentración de indólicos se multiplico por 1,8 tras la aplicación de 10 mM triptófano, y aumentó un 33% y un 51% con los tratamientos de 100 µM SA y de 25 µM MeJA, respectivamente.

Los resultados obtenidos indicaron que la aplicación prolongada de bajas concentraciones de aminoácidos y moléculas inductoras del metabolismo secundario durante la etapa de desarrollo de los brotes de brócoli es un método útil y efectivo para estimular la biosíntesis de fitoquímicos bioactivos y mejorar el valor nutricional de los brotes de brócoli, ampliando así las posibilidades de aplicación de este alimento para su consumo como ingrediente en alimentos funcionales.

El recuento de mohos y levaduras tras 16 días de conservación en brotes envasados con plástico macroperforado y con plástico de elevada permeabilidad fue significativamente menor que en el resto de las condiciones estudiadas

Efecto de las condiciones de envasado en la calidad nutricional de los brotes de brócoli

Tras determinar los efectos de diversas condiciones de estrés en la biosíntesis y acumulación de compuestos bioactivos se abordó el estudio del efecto de distintos tipos de plásticos de envasado en la calidad microbiológica y fitoquímica de los brotes de brócoli durante su almacenamiento a baja temperatura (1 °C).

El recuento de mohos y levaduras tras 16 días de conservación en brotes envasados con plástico macroperforado y con plástico de elevada permeabilidad fue significativamente menor que en el resto de las condiciones estudiadas. Los brotes de brócoli presentaron una concentración inicial de vitamina C de 64 mg 100 g-1 pf, preservándose durante el periodo de almacenamiento en los brotes envasados con plástico macroperforado, alcanzando valores significativamente superiores a los obtenidos con las demás condiciones de envasado.

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El periodo 16 días de almacenamiento originó una reducción significativa de compuestos fenólicos ya que la concentración inicial [185 mg 100 g-1 pf en brotes de 5 días; principalmente, flavonoides derivados de quercetina y kaempferol], disminuyó un 27% durante el almacenamiento a baja temperatura, pero sin diferencias entre los plásticos empleado. También el periodo de conservación indujo pérdidas en la concentración de glucosinolatos, aunque fueron de distinta magnitud en función del tipo de envasado empleado. La concentración de glucosinolatos en brotes envasados con plástico macroperforado fue un 13, 17, y 62% mayor que en los brotes envasados con plástico de permeabilidad alta, media y baja, respectivamente.

Tras el análisis de los resultados obtenidos se determinó que el empleo de un plástico de envasado macroperforado que permita el intercambio natural de gases (21% O2 + 0,04% CO2) entre el espacio interior y exterior del envase es la opción más conveniente para preservar la calidad organoléptica y microbiológica, así como para mantener la concentración de compuestos fitoquímicos bioactivos durante el periodo de vida útil de los brotes de brócoli enriquecidos.

Los resultados obtenidos mostraron que la aplicación de determinados factores de estrés de tipo abiótico y biótico puede aumentar la concentración de compuestos fitoquímicos bioactivos y, por consiguiente, mejorar las propiedades beneficiosas para la salud derivadas del consumo de brotes de brócoli.
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