En el caso de los frutales la enfermedad provocada por Agrobacterium spp. afecta principalmente en la fase de vivero

El ‘crown gall’ o agalla de corona es una enfermedad causada por el patógeno del suelo ‘Agrobacterium tumefaciens’ y que afecta de forma muy importante a muchas dicotiledóneas, incluyendo numerosos frutales, entre ellos los del género ‘Prunus’. En este trabajo pretendemos comprobar la eficacia de una construcción molecular desarrollada en nuestro laboratorio para obtener plantas de ciruelo europeo (‘Prunus domestica’ L.) resistentes a la agalla de la corona.

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena que se encuentra en el suelo. Es capaz de infectar las plantas a través de heridas producidas durante las labores de trasplante o mantenimiento cuando se utilizan herramientas infectadas o bien a través de insectos y nematodos del sistema radicular. Su infección produce tumores principalmente en la base del tallo de la planta conocidos como ‘agallas de corona’ o ‘crown gall’ en inglés. Esta enfermedad causa graves daños económicos en numerosas especies dicotiledóneas de casi 100 familias, incluyendo los frutales de hueso, vid, rosa y otras plantas ornamentales (De Cleene y De Ley, 1976). La presencia de tumores en las raíces, cuello y a veces en la parte aérea de las plantas puede causar fallos en el desarrollo vegetativo y afectar negativamente a los sistemas radicular y vascular.

En el caso de los frutales la enfermedad provocada por Agrobacterium spp. afecta principalmente en la fase de vivero (Cubero et al., 2006) y causa graves daños económicos, ya que los viveristas deben deshacerse de las plantas infectadas y extremar las medidas sobre el control sanitario. En árboles con tumores la productividad se ve reducida e incrementa su susceptibilidad a otros patógenos y a estreses medioambientales.

Para el control de la agalla de corona se han utilizado diferentes métodos que incluyen el control biológico utilizando la cepa no patogénica de Agrobacterium rhizogenes K84 (Rhouma et al., 2008) aunque, esta es efectiva solamente con algunos tipos de agrobacterias. Se han evaluado otros organismos que reducen parcialmente la formación de tumores: Agrobacterium vitis VAR03-1 (Kawaguchi et al., 2008), rizobacterias BSCH14 y O33 (Rhouma et al., 2008) o Bacillus subtilis (Gupta y Khosla, 2007). Adicionalmente al control biológico, se han utilizado también tratamientos de solarización combinados con antagonistas biológicos (Gupta y Khosla, 2007). La desventaja de estas estrategias es que, en el mejor de los casos, sólo consiguen atenuar los síntomas de la enfermedad.

Plantas de ciruelo europeo evaluadas para la resistencia a la agalla de la corona en invernadero.

Las estrategias tradicionales de mejora para obtener plantas resistentes han tenido éxito solo en aquellas especies en las que existe germoplasma resistente y, aun así, son necesarias décadas para alcanzar este objetivo. En Prunus hay pocos estudios que indiquen la existencia de variedades resistentes (Guzmán et al., 2007) lo que dificulta enormemente su mejora con estrategias tradicionales.

La infección de las células vegetales por Agrobacterium comporta la transferencia del T-DNA de la bacteria a la célula vegetal, donde se transporta al núcleo y se integra en el genoma vegetal. Dentro de este T-DNA se encuentran los oncogenes (ipt, iaaM e iaaH) cuya expresión induce la sobre-producción de citoquininas y auxinas provocando un crecimiento y división celular descontrolada y formación del tumor. La inactivación del gen ipt y cualquiera de los otros dos genes implicados en la biosíntesis de auxinas evita que Agrobacterium pueda formar las agallas en los tejidos de la planta (Zhu et al., 2000). Las estrategias biotecnológicas más eficientes utilizadas hasta la fecha para conferir resistencia a la agalla de corona se basan en la utilización de construcciones que generan ARNs de doble cadena y en forma de pinza conocidos como hpARNs, silenciando los oncogenes ipt e iaaM. En nuestro grupo se ha diseñado una nueva construcción para silenciar los oncogenes de la bacteria utilizando un gen quimérico de reducido tamaño y se ha comprobado su efectividad para producir plantas de tabaco resistentes a la agalla de la corona (Alburquerque et al., 2012). Utilizando el protocolo altamente eficiente de transformación de ciruelo europeo (Prunus domestica L.) desarrollado por Petri et al. (2008), el objetivo de este trabajo es producir plantas de ciruelo resistentes a la enfermedad provocada por Agrobacterium tumefaciens con la construcción realizada en nuestro laboratorio.

Se han llevado a cabo experimentos de transformación de hipocotilos de semillas de la variedad ‘Claudia Verde’, ‘Stanley’ y ‘Claudia Tolosa’ de ciruelo (Prunus domestica L.) aplicando el protocolo de transformación previamente descrito por Petri et al. (2008). Se han producido diferentes líneas transgénicas conteniendo la construcción diseñada para silenciar los oncogenes de Agrobacterium tumefaciens (Alburquerque et al., 2012).

Se realizaron las extracciones de ADN a partir de 100 mg de hojas de brotes micropropagados in vitro de las posibles líneas transgénicas utilizando el protocolo publicado por Doyle y Doyle (1987). Para comprobar que las líneas habían incorporado los transgenes se realizó una evaluación mediante PCR (polymerase chain reaction) Se utilizaron cebadores específicos para la amplificación del transgen nptII. El producto de la amplificación del ADN se detectó por electroforesis en un gel de agarosa 1% (p/v) y después de teñir con bromuro de etidio se visualizó bajo luz ultravioleta.

Líneas transgénicas de ciruelo europeo micropropagadas in vitro.

Para evaluar la resistencia de estas plantas a la agalla de corona se ha utilizado un protocolo que consiste en infectar brotes micropropagados in vitro de cada línea transgénica de ciruelo y brotes no transgénicos pinchando en el tallo una gota de solución de la cepa oncogénica de Agrobacterium C58 con D.O.₆₀₀ = 0,3. Transcurrido un mes se observó la aparición de síntomas o callogénesis. Los síntomas se diferenciaron en tres niveles: 0 o ausencia de callo, 1 o aparición de callo que no supera el diámetro del tallo del brote y 2 cuando el callo desarrollado es más grande que el diámetro del tallo (Figura 1). También se tomó el tamaño del callo.

Figura 1: Detalle de los síntomas observados en tallos de brotes de ciruelo micropropagados transcurrido un mes desde su infección con 'Agrobacterium tumefaciens' cepa C58. A. Nivel de síntomas 0. B. Nivel de síntomas 1. C. Nivel de síntomas 2. La barra representa 2 mm.

Para evaluar la resistencia a la enfermedad en el invernadero se enraizaron y aclimataron plantas de algunas líneas y de controles no transformados. Se infectaron siguiendo un protocolo descrito previamente (Cervera et al., 1998; Petri et al., 2004), que consiste en introducir en el tallo de cada planta 5 µL de una solución de la cepa oncogénica de Agrobacterium C58 con D.O.₆₀₀ = 0,3. Transcurridas 8 semanas se evaluó la aparición de síntomas o callogénesis y se tomó el peso de los callos generados (Figura 2).

Figura 2: A. Planta de ciruelo infectadas en el invernadero con la cepa C58 de 'Agrobacterium tumefaciens'. Detalle de los síntomas observados en tallos de plantas de ciruelo transcurridas 8 semanas desde su infección. B. Nivel de síntomas 0. C. Nivel de síntomas 1. D. Nivel de síntomas 2. La barra representa 10 mm.

Tras los experimentos de transformación llevados a cabo con material de semillas de las variedades de ciruela ‘Claudia verde’, ‘Stanley’ y ‘Claudia Tolosa’ se aislaron yemas regeneradas en medio que contenía kanamicina como agente selectivo y se establecieron distintas líneas. La presencia del gen de resistencia a aminoglicósidos nptII se ha comprobado mediante PCR (Figura 3) en aquellas líneas capaces de crecer en medio con 80 mg/L de kanamicina, resultando positiva en todas las líneas analizadas.

Figura 3: Amplificación mediante PCR de un fragmento del gen nptII presente en plantas de ciruelo transformadas. Calle 1: control negativo; calles 2-7: diferentes líneas de ciruelo transgénicas; calle 8: agua, M: marcador molecular de ADN 1000 pares de bases, P: control positivo (plásmido).

El test desarrollado in vitro nos permitió evaluar un número elevado de líneas transgénicas. De 17 líneas establecidas, 6 mostraron síntomas significativamente menores que los observados en los controles, siendo consideradas líneas tolerantes. En una de las líneas evaluadas in vitro no se observaron síntomas (C103-6), y en otras dos fueron casi inapreciables (CT106-11 y S106-1), lo que indica que podrían ser resistentes a la agalla de la corona (Figura 4). En cuanto a los tamaños del callo observado, los resultados coinciden con los obtenidos para la aparición de síntomas (Figura 5) y corroboran la obtención de un total de 9 líneas tolerantes o resistentes a la enfermedad producida por Agrobacterium tumefaciens.

Figura 4: Síntomas (0-2) observados en tallos de brotes micropropagados in vitro de plantas de ciruelo tras 4 semanas desde su infección con la cepa oncogénica de 'Agrobacterium tumefaciens' C58.

Figura 5: Tamaño de callo (mm) observado en tallos de brotes micropropagados in vitro de plantas de ciruelo tras 4 semanas desde su infección con la cepa oncogénica de 'Agrobacterium tumefaciens' C58.

Se seleccionaron seis líneas transgénicas, cinco tolerantes o resistentes y una sensible para su evaluación en el invernadero. De las seis líneas evaluadas, en una (S103-3) aparecieron síntomas significativamente menores que los observados en el control infectado con la cepa oncogénica y menor peso de los callos generados, lo que confirma que es una línea tolerante a la enfermedad (Figura 6). En tres de las líneas evaluadas (CT106-11, S103-2 y C103-61) no se observaron síntomas, lo que indica que son resistentes a la agalla de la corona.

Figura 6: Síntomas (0-2) y peso de los callos (mg) observados en tallos de plantas in vivo de plantas de ciruelo tras 8 semanas desde su infección con la cepa oncogénica de 'Agrobacterium tumefaciens' C58.

Utilizando una construcción molecular diseñada en nuestro laboratorio que permite silenciar conjuntamente los oncogenes de Agrobacterium tumefaciens hemos producido líneas de ciruelo europeo que tras su evaluación en el invernadero han resultado resistentes o tolerantes a la enfermedad de la agalla de la corona.

Referencias bibliográficas

• Alburquerque N., Petri C., Faize L. y Burgos L. (2012) A short-length single chimeric transgene induces simultaneous silencing of Agrobacterium tumefaciens oncogenes and resistance to crown gall. Plant Pathology, (En prensa)
• Cervera M., López M.M., Navarro L. y Peña L. (1998) Virulence and supervirulence of Agrobacterium tumefaciens in woody fruit plants. Physiological and Molecular Plant Pathology, 52: 67-78.
• Cubero J., Lastra B., Salcedo C.I., Piquer J. y López M.M. (2006) Systemic movement of Agrobacterium tumefaciens in several plant species. Jounal of Applied Microbiology, 101: 412-421.
• De Cleene M. y De Ley J. (1976) The host range of crown gall. The Botanical Review, 42: 389-466.
• Doyle J.F. y Doyle J.L. (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19: 11-15.
• Gupta A.K. y Khosla K. (2007) Integration of soil solarization and potential native antagonist for the management of crown gall on cherry rootstock colt. Scientia Horticulturae, 112: 51-57.
• Guzmán G., Latorre B.A., Torres R. y Wilcox W.F. (2007) Relative susceptibility of peach rootstocks to crown gall and Phytophthora root and crown rot in Chile. Ciencia e Investigación Agraria, 34: 23-32.
• Kawaguchi A., Inoue K. y Ichinose Y. (2008) Biological control of crown gall of grapevine, rose and tomato by nonpathogenic Agrobacterium vitis strain VAR03-1. Phytopathology, 98: 1218-1225.
• Petri C., Alburquerque N., García-Castillo S., Egea J. y Burgos L. (2004) Factors affecting gene transfer efficiency to apricot leaves during early Agrobacterium-mediated transformation steps. Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 79: 704-712.
• Petri C., Webb K., Hily J.M., Dardick C. y Scorza R. (2008) High transformation efficiency in plum (Prunus domestica L.): a new tool for functional genomics studies in Prunus spp. Molecular Breeding, 22: 581-591.
• Rhouma A., Bouri M., Boubaker A. y Nesme X. (2008) Potential effect of rhizobacteria in the management of crown gall disease caused by Agrobacterium tumefaciens biovar 1. Journal of Plant Pathology, 90: 517-526.
• Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J.J., Farrand S.K. y Winans S.C. (2000) The bases of crown gall tumorigenesis. Journal of Bacteriology, 182: 3885-3895.