Aspectos inmunológicos de la tuberculosis pulmonar ovina en fases iniciales de desarrollo

Miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT) pueden infectar al ganado ovino. Se ha caracterizado histológica e inmunohistoquímicamente granulomas pulmonares causados por diferentes especies del CMT en 12 ovejas. Se clasificaron, cuantificaron y describieron granulomas en estadios iniciales de desarrollo. M. bovis de alta patogenicidad y M. caprae inducen un mayor número de granulomas siendo más patógenas. La escasez de TNF-α en los granulomas puede explicar esa falta de organización en los primeros estadios. El IFN-γ se observó en células epitelioides, linfocitos y células gigantes multinucleadas tipo Langhans, siendo más intensa en las especies más patógenas. El estudio ayuda a entender las primeras etapas de desarrollo de la tuberculosis por distintas cepas del CMT en oveja.

La tuberculosis de los mamíferos es una enfermedad de declaración obligatoria causada por varias especies de micobacterias que pertenecen al complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT); principalmente M. bovis, M. caprae y M. tuberculosis (OMSA, 2022). La principal especie afectada es el bovino, aunque hay un amplio espectro de especies de animales domésticos o silvestres que son susceptibles. Entre ellas destacamos el caprino, y en menor medida el ganado porcino y el ovino (OMSA, 2022).

La patogénesis y respuesta inmunitaria específica frente a la tuberculosis en ovinos domésticos ha sido poco estudiada (Malone et al., 2003; van der Burgt et al., 2013). Esto es debido a que históricamente las ovejas se han considerado una especie naturalmente resistente a la infección por M. bovis, en comparación con otros rumiantes. Sin embargo, existen evidencias que sugieren que las ovejas actúan como reservorio de M. bovis, sobre todo si comparten pastos con rumiantes (Vallejo et al., 2018). M. caprae es la segunda especie que más frecuentemente causa tuberculosis en ovejas, después de M. bovis. M. tuberculosis se ha considerado menos importante en la epidemiología de la tuberculosis en pequeños rumiantes.

El estudio de la patología específica de la tuberculosis por M. bovis en las ovejas sugiere diferencias estructurales en los granulomas, con respecto a las lesiones observadas en bovinos o caprinos domésticos (García-Jiménez et al., 2012; Salguero et al., 2017). En concreto, los granulomas por M. bovis en ovejas contienen un número reducido de células T, lo que ha llevado a algunos autores a concluir que su participación tiene poca importancia en los primeros estadios de la infección. Las lesiones tuberculosas en ovejas tienen en común con las lesiones observadas en bovinos que abundan células epitelioides, indicando un predominio de la respuesta inmune innata inespecífica (Vallejo et al., 2018). Además, otra similitud entre ovejas y vacas es que a medida que la lesión se cronifica, se observa un incremento en el número de células B y plasmáticas, sugiriendo una respuesta inmune predominantemente humoral.

En el desarrollo temprano del granuloma, gracias a la actividad de los células epitelioides y linfocitos, se generan una serie de citoquinas pro-inflamatorias entre las que destacan el interferón gamma (IFN-?) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Cheng et al., 2016). Las células T producen IFN-? y este se encarga de la activación de los macrófagos gracias a su actuación sinérgica con el TFN-α (Barnes & Wizel, 2000; Kaufmann, 2002). Existen varios estudios realizados en bovino donde se describe la actuación del IFN-? y TFN-α (Canal et al., 2017), pero ninguno en ovino.

Se revisó retrospectivamente la base de datos del Servicio de Investigación en Patología Animal y Veterinaria Forense del Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET-UCM) y se seleccionaron los bloques de parafina correspondientes a pulmones de ovejas pertenecientes al proyecto Antigone (PROEX 234/14). En este experimento realizado en el nivel de bioseguridad BSL3 se infectaron 12 ovejas (Ovis orientalis aries) vía intravenosa con una dosis de 106 UFC en 2 ml de PBS de diferentes inóculos de micobacterias pertenecientes al complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT). En concreto, 4 grupos (n=3 animales por grupo): 1) grupo inoculado con M. bovis de alta patogenicidad espoligotipo SB0134; 2) grupo inoculado con M. bovis de baja patogenicidad espoligotipo SB0339; 3) grupo inoculado con M. caprae espoligotipo SB0157; 4) grupo inoculado con M. tuberculosis espoligotipo SIT451. Se confirmó la infección, se fijaron los órganos formalina, y se procedió al tallado, inclusión, corte y tinción.

Se usaron las tinciones de hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson para poder estudiar histológicamente las características diferenciales entre las lesiones inducidas por las distintas micobacterias. Para evaluar la carga bacilar se realizó un Ziehl-Neelsen. Gracias a la expresión membranosa de CD3+ y Pax5 se pudo diferenciar linfocitos T y B respectivamente. Por último, se observó la inmunoexpresión de TNF-α y IFN-γ en el citoplasma de células inflamatorias. La obtención de imágenes se llevó a cabo empleando un microscopio óptico (DM2000, Leica) con una cámara digital (MC170 HD, Leica) acoplada, empleando un software comercial de procesamiento de imágenes (Leica Application Suite, versión 4.6.0, Leica).

Los granulomas se clasificaron según lo establecido en el estudio de Wangoo y colaboradores (Figura 1) en granulomas tuberculosos bovinos de forma que, los de estadio I (inicial) presentan células epitelioides agrupadas con linfocitos, neutrófilos y algunas células gigantes multinucleadas de tipo Langhans. El estadio II (sólido) se aprecia la misma población celular, rodeada por una cápsula incompleta y una ligera necrosis central. En el estadio III existe una cápsula completa, con necrosis central mineralizada y caseosa y, en el estadio IV, aparece un granuloma grande, irregular, de cápsula gruesa, con un centro de necrosis caseosa y mineralización que ocupa gran parte del granuloma. Aquí, los granulomas tienden a coalescer unos con otros. El objetivo ha sido analizar los granulomas incipientes, de forma que el estudio se centra en ellos para la evaluación histológica, inmunohistoquímica y de la carga bacilar.

El estudio histológico de las lesiones causadas por cada una de las tres especies de micobacterias (M. bovis - alta y baja virulencia, M. caprae, M. tuberculosis) de forma experimental vía hematógena en ovejas revela múltiples granulomas pulmonares de diferente estadio histológico (I y II).

Hay estudios que no evidencian cambios morfológicos entre las distintas cepas de micobacterias en bovino (Ozturk-Gurgen et al., 2020) pero en este caso sí se aprecian. Existen diferencias en la composición de los tipos celulares predominantes y en su disposición en los granulomas pulmonares ovinos entre las especies del CMT estudiadas. El estudio histológico muestra que las células epitelioides son la población celular predominante independientemente de la especie de micobacteria estudiada, lo que coincide con otros autores que describen la tuberculosis ovina (Palmer et al., 2022; Vallejo et al., 2018). En cuanto a las células gigantes multinucleadas de tipo Langhans, se encontraban en todas las muestras estudiadas destacando su mayor número y tamaño en ovejas infectadas por las especies/espoligotipos de micobacterias del CMT más patógenas para el ganado ovino como lo son M. bovis de alta patogenicidad y M. caprae (Figura 2A y Figura 2B).

Se ha visto que en otras especies animales los neutrófilos contribuyen a la formación del granuloma (Canfield et al., 2002). En ovino no se ha demostrado su relevancia y en este estudio no destaca su presencia, pero en humana pueden determinar el curso de la enfermedad a una tuberculosis proliferativa o exudativa de forma que seguirá siendo objeto de estudio en el ovino y otras especies (Cardona, 2018).

Con la técnica tricrómico de Mason, se observa la presencia de tejido conjuntivo de color azul de forma progresiva en las lesiones pulmonares ovinas, en pequeñas cantidades en el interior del granuloma tipo I y que tiende a formar una pequeña capa incompleta en la zona exterior del granuloma tipo II. El depósito y la formación de capa de tejido conjuntivo era mayor en aquellas especies de micobacterias más patógenas como era el caso de M. bovis de alta patogenicidad y M. caprae (Figura 2B).

El número de bacilos se evaluó de acuerdo con lo descrito por Wangoo y colaboradores (Wangoo et al., 2005). Los granulomas se clasifican en función de su carga bacilar del grado 0 al 3 (O: ausencia de bacilos, 1: 1-2 bacilos, 2: 1-5 bacilos y 3: >5 bacilos). En aquellos granulomas en los que se observaron bacilos ácido-alcohol resistentes mediante Ziehl-Neelsen, estos se encontraban en el citoplasma de las células epitelioides y/o en el citoplasma de las células gigantes multinucleadas de tipo Langhans. El número de bacilos aumentaba conforme evolucionaba el granuloma independientemente de la especie. Pese a esto, ningún granuloma superó los 5 bacilos por granuloma. Existen autores que describen granulomas tuberculosos en ovejas con resultados similares a los encontrados en este estudio en los que la carga bacilar era baja (Cordes et al., 1981). Esto puede deberse a una dosis infectiva baja o a la eliminación de la bacteria.

Independientemente de la especie/espoligotipos de micobacteria del CMT estudiada, se observó un número importante de linfocitos T, con inmunoreacción frente a CD3+, en granulomas incipientes (estadio I y II) (Figura 2C). Lo que sugiere que estas células son cruciales en los primeros estadios de la tuberculosis ovina, ya que actúan como primera línea de defensa y como puente entre la respuesta inmune innata y adaptativa (Palmer et al., 2019; Salguero et al., 2017). El número disminuía y se organizaba en la periferia conforme cronificaba el granuloma (Figura 3A), es una razón por la que puede que algunos estudios les hayan restado importancia, ya que solo se han centrado en granulomas maduros con pocos linfocitos T (Vallejo et al., 2018).

En este trabajo, se ha observado que, a excepción de M. bovis de alta patogenicidad, las células B-plasmáticas (Pax5) están dispersas en el granuloma en los primeros estadios (Figura 3B), agrupándose en la periferia a medida que el granuloma progresa (Figura 2D). Esto pasa en otros estudios realizados en oveja y vaca y se cree que estas células ayudan a la coordinación de la respuesta inmune y limitan la progresión de los granulomas, en este caso, en el pulmón (Canal et al., 2017; Vallejo et al., 2018; Wangoo et al., 2005). La presencia de estos clústeres de células B en estadios de granulomas pulmonares incipientes podrían contribuir a la mayor resistencia a la tuberculosis que se atribuye al ganado ovino.

En las ovejas de este estudio, la expresión de IFN-γ en los granulomas pulmonares I y II, se ha observado en células epitelioides, linfocitos y células gigantes multinucleadas tipo Langhans indistintamente de la especie/espoligotipos de micobacteria del CMT estudiada, siendo más intensa en las especies más patógenas M. caprae (Figura 2F) y M. bovis de alta patogenicidad. La expresión de TNF-α fue escasa en general (Figura 2E), siendo más evidente en los granulomas tipo I inducidos por M. bovis de baja patogenicidad y M. tuberculosis.

El IFN-γ es clave para el control de la tuberculosis y el tener tanta reacción positiva (Figura 3C) en este caso puede explicar esa mayor resistencia de las ovejas a la enfermedad (Palmer et al., 2019). El IFN-γ y el TNF-α actúan de forma sinérgica activando a los macrófagos (Kaufmann, 2002) y ayudando a la organización del granuloma, aunque esto sigue siendo objeto de estudio. La escasez de TNF-α en los granulomas (Figura 3D) puede explicar esa falta de organización en los primeros estadios (Palmer et al., 2019, 2022).

La respuesta inmune innata y adquirida están en equilibrio en la formación del granuloma. M. bovis de alta patogenicidad y M. caprae presentaban un predominio de respuesta inmune innata al inducir un mayor número de células gigantes multinucleadas tipo Langhans y células epitelioides. Por el contrario, M. bovis de baja patogenicidad y M. tuberculosis presentaban una mayor cantidad de células pertenecientes a la respuesta inmune adaptativa, como son el mayor porcentaje de linfocitos B/células B-plasmáticas y linfocitos T.

La mayor resistencia de la especie ovina frente a la tuberculosis podría ser consecuencia de una marcada producción de IFN-γ junto con un elevado porcentaje de linfocitos T y la presencia de grupos de linfocitos B/células plasmáticas en estadios iniciales del desarrollo de los granulomas en el pulmón que limitarían la progresión de la enfermedad.

Bibliografía

• Barnes, P. F., & Wizel, B. (2000). Type 1 cytokines and the pathogenesis of tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 161(6), 1773-1774. https://doi.org/10.1164/ajrccm.161.6.16167
• Canal, A. M., Pezzone, N., Cataldi, A., Zumarraga, M., Larzabal, M., Garbaccio, S., Fernandez, A., Dominguez, L., Aranaz, A., & Rodriguez-Bertos, A. (2017). Immunohistochemical detection of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in granulomas in cattle with natural Mycobacterium bovis infection. Research in Veterinary Science, 110, 34-39. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2016.10.006
• Canfield, P. J., Day, M. J., Gavier-Widen, D., Hewinson, R. G., & Chambers, M. A. (2002). Immunohistochemical Characterization of Tuberculous and Non-tuberculous Lesionsin Naturally Infected European Badgers (Meles meles). Journal of Comparative Pathology, 126(4), 254-264. https://doi.org/10.1053/jcpa.2002.0549
• Cardona, P.-J. (2018). Pathogenesis of tuberculosis and other mycobacteriosis. Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clinica (English Ed.), 36(1), 38-46. https://doi.org/10.1016/j.eimce.2017.10.009
• Cheng, Y., Huang, C., & Tsai, H.-J. (2016). Relationship of bovine TNF-α gene polymorphisms with the risk of bovine tuberculosis in Holstein cattle. Journal of Veterinary Medical Science, 78(5), 727-732. https://doi.org/10.1292/jvms.15-0506
• Cordes, D. O., Bullians, J. A., Lake, D. E., & Carter, M. E. (1981). Observations on tuberculosis caused by Mycobacterium bovis in sheep. New Zealand Veterinary Journal, 29(4), 60-62. https://doi.org/10.1080/00480169.1981.34798
• García-Jiménez, W. L., Fernández-Llario, P., Gómez, L., Benítez-Medina, J. M., García-Sánchez, A., Martínez, R., Risco, D., Gough, J., Ortiz-Peláez, A., Smith, N. H., Mendoza, J. H. de, & Salguero, F. J. (2012). Histological and immunohistochemical characterisation of Mycobacterium bovis induced granulomas in naturally infected Fallow deer (Dama dama). Veterinary Immunology and Immunopathology, 149(1-2), 66-75. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2012.06.010
• Kaufmann, S. H. E. (2002). Protection against tuberculosis: Cytokines, T cells, and macrophages. Annals of the Rheumatic Diseases, 61 Suppl 2(Suppl 2), ii54-58. https://doi.org/10.1136/ard.61.suppl_2.ii54
• Malone, F. E., Wilson, E. C., Pollock, J. M., & Skuce, R. A. (2003). Investigations into an Outbreak of Tuberculosis in a Flock of Sheep in Contact with Tuberculous Cattle. Journal of Veterinary Medicine Series B, 50(10), 500-504. https://doi.org/10.1046/j.1439-0450.2003.00714.x
• Organización Mundial de Sanidad Animal (2022). Código Sanitario para los Animales Terrestres. Capítulo 8.12.- Infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis. https://www.woah.org/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahc/current/chapitre_bovine_tuberculosis.pdf
• Ozturk-Gurgen, H., Rieseberg, B., Leipig-Rudolph, M., Straubinger, R. K., & Hermanns, W. (2020). Morphology of naturally-occurring tuberculosis in cattle caused by mycobacterium caprae. Journal of Comparative Pathology, 174, 120-139. https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2019.11.010
• Palmer, M. V., Kanipe, C., & Boggiatto, P. M. (2022). The Bovine Tuberculoid Granuloma. Pathogens, 11(1), 61. https://doi.org/10.3390/pathogens11010061
• Palmer, M. V., Wiarda, J., Kanipe, C., & Thacker, T. C. (2019). Early Pulmonary Lesions in Cattle Infected via Aerosolized Mycobacterium bovis. Veterinary Pathology, 56(4), 544-554. https://doi.org/10.1177/0300985819833454
• Salguero, F. J., Gibson, S., Garcia-Jimenez, W., Gough, J., Strickland, T. S., Vordermeier, H. M., & Villarreal-Ramos, B. (2017). Differential Cell Composition and Cytokine Expression Within Lymph Node Granulomas from BCG-Vaccinated and Non-vaccinated Cattle Experimentally Infected with Mycobacterium bovis. Transboundary and Emerging Diseases, 64(6), 1734-1749. https://doi.org/10.1111/tbed.12561
• Vallejo, R., García Marín, J. F., Juste, R. A., Muñoz-Mendoza, M., Salguero, F. J., & Balseiro, A. (2018). Immunohistochemical characterization of tuberculous lesions in sheep naturally infected with Mycobacterium bovis. BMC Veterinary Research, 14(1), 154. https://doi.org/10.1186/s12917-018-1476-2
• van der Burgt, G. M., Drummond, F., Crawshaw, T., & Morris, S. (2013). An outbreak of tuberculosis in Lleyn sheep in the UK associated with clinical signs. Veterinary Record, 172(3), 69-69. https://doi.org/10.1136/vr.101048
• Wangoo, A., Johnson, L., Gough, J., Ackbar, R., Inglut, S., Hicks, D., Spencer, Y., Hewinson, G., & Vordermeier, M. (2005). Advanced Granulomatous Lesions in Mycobacterium bovis-infected Cattle are Associated with Increased Expression of Type I Procollagen, γδ (WC1+) T Cells and CD 68+ Cells. Journal of Comparative Pathology, 133(4), 223-234. https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2005.05.001