Estrategias de prevención de listeriosis en rumiantes: uso de probióticos y bacteriocinas en ensilados

Las bacteriocinas o bacterias probióticas que las producen se han estudiado en ensilados y se ha confirmado que facilitan el control de la listeria. Además, se ha demostrado que las bacterias productoras de ácido láctico son eficaces para eliminar Listeria. Hay dos mecanismos implicados: por un lado, la reducción del pH que estas bacterias producen durante la fermentación, creando condiciones poco favorables a la reproducción del patógeno y, por otro lado, la producción de bacteriocinas por cepas tales como E. faecium y Lactobacillus spp., que provocan la muerte de L. monocytogenes. Además, existe una sinergia entre los diferentes antimicrobianos que permite cubrir los riesgos y evitar la aparición de resistencias. Por todo ello, enfocarse en las combinaciones entre cepas probióticas parece ser una buena estrategia para mejorar el control de la listeriosis.

Listeria monocytogenes es una bacteria que está ampliamente distribuida en el ambiente, pero también tiene la capacidad de causar una grave enfermedad invasiva en rumiantes y humanos (Quereda et al., 2021). En la década de 1980 se comprobó por primera vez que L. monocytogenes era el agente causante de enfermedades transmitidas por los alimentos en humanos (Schlech et al., 1983). Desde entonces, se ha asociado con una amplia gama de diferentes productos alimenticios, incluyendo quesos (Linnan et al., 1988). Esta bacteria está ampliamente distribuida en el medio ambiente donde vive como un saprófito, sin embargo, cuando se ingiere en cantidades importantes por humanos o animales es capaz de convertirse en un patógeno intracelular (Quereda et al., 2021).

En humanos, la listeriosis afecta mayoritariamente a ancianos, embarazadas, recién nacidos u otros pacientes inmunodeprimidos en los cuales causa partos prematuros, abortos, meningitis, septicemia e incluso muerte en hasta el 30% de los casos (Charlier et al., 2017). En individuos inmunocompetentes sanos el cuadro clínico es más leve, manifestándose como una gastroenteritis febril. Es importante notar que la cantidad estimada de bacteria necesaria para que enferme un individuo sano es de 109 unidades formadoras de colonia (UFC)/g de alimento contaminado mientras que solo 10⁶ UFC/g pueden provocar síntomas graves en individuos susceptibles (Quereda et al., 2021). El mayor brote de listeriosis en España ocurrió en 2019 en Andalucía y afectó a 222 personas, incluyendo 6 abortos y 3 muertes por consecuencia del consumo de carne mechada contaminada por L. monocytogenes. Aunque los casos confirmados de listeriosis se han mantenido estables en los últimos años en Europa, se ha observado un incremento significativo de los casos entre 2009 y 2018 (‘The European Union One Health 2022 Zoonoses Report’, 2023).

En pequeños rumiantes, la listeriosis se caracteriza en general por causar cuadros nerviosos y de malestar, tales como depresión o anorexia, junto a signos más específicos como ladeo de la cabeza, parálisis facial, salivación, movimientos en círculos o ataxia. Además, se describen casos de abortos en los últimos momentos de la preñez, septicemia generalmente en neonatos, gastroenteritis y ocasionalmente mastitis (Quereda et al., 2021). Listeria spp. es ubicua en la naturaleza, y se puede encontrar por ejemplo en el suelo, el agua, las granjas y la industria alimentaria. Su amplia distribución le permite contaminar alimentos, lo que resulta en su llegada final a los seres humanos. Los alimentos que más riesgos presentan son los productos listos para el consumo que tienen una larga vida útil como, por ejemplo, los patés y salchichas, las ensaladas preparadas o el pescado ahumado. Los productos lácteos hechos con leche cruda, los mariscos, las verduras y frutas frescas son también fuente de L. monocytogenes (‘The European Union One Health 2022 Zoonoses Report’, 2023). Otra característica fundamental de L. monocytogenes es su capacidad de supervivencia y crecimiento en ambientes adversos como las bajas temperaturas (4°C), en presencia de desinfectantes, ácidos y sales. Finalmente, es capaz de formar biofilms, es decir, un agrupamiento de bacterias adheridas a una superficie y recubiertas de una matriz extracelular protectora. Formar parte de esta comunidad bacteriana estrechamente unida le permite resistir a los desinfectantes y productos de limpieza. Prevenir la entrada de L. monocytogenes en la cadena alimentaria es un desafío, debido a su ubicuidad y alta resistencia (Freitag et al., 2009). Actualmente, se están desarrollando muchos estudios para comprender cómo este patógeno circula entre animales, humanos y el medio ambiente (Palacios-Gorba et al., 2023; Palacios-Gorba et al., 2021a, b).

La búsqueda de nuevas soluciones diseñadas para prevenir o restringir el crecimiento de L. monocytogenes desde la fase primaria de la producción hasta el consumo del producto final es fundamental. En el contexto de limitación de uso de antibióticos, el uso de los probióticos como manera de controlar el crecimiento de L. monocytogenes puede ser clave. Los probióticos son una mezcla de una o varias cepas de bacterias que tienen un efecto beneficioso, por ejemplo, en la microbiota de quien las consuma o estabilizando la conservación de un producto (Gibson et al., 2017).

Tanto en humanos como en rumiantes, la infección por L. monocytogenes se produce principalmente por el consumo de alimento contaminado en el que estas bacterias se multiplican fácilmente, lo que puede resultar en brotes clínicos en rebaños (Gray, 1960; Vázquez-Boland et al., 1992; Wilesmith & Gitter, 1986). Listeria está presente en el suelo y/o en los purines usados para la fertilización de los campos de cultivo y, por lo tanto, puede acabar en los ensilados proviniendo de estos campos (Queiroz et al., 2018). Al consumir el ensilado contaminado por este microorganismo, el ganado se infecta, acaba excretando la bacteria en sus heces y diseminándola por el resto de la explotación o el entorno por donde pasten esos animales. La leche se puede contaminar por una superficie mamaria manchada con heces o por la infección intramamaria de Listeria, lo que motiva la presencia del patógeno en la leche cruda y en la industria de productos lácteos (Ouamba et al., 2022). Tener casos de listeriosis en una granja supone una pérdida económica grave, tanto de forma directa debido al coste de los tratamientos antimicrobianos, el sacrificio de animales que sufren neurolisteriosis o abortos, así como pérdidas indirectas debido a las pérdidas de producción. Por lo tanto, es fundamental controlar la presencia de Listeria desde el inicio de la cadena alimentaria, siguiendo la estrategia ‘De la granja al tenedor’.

En el ensilado, las bacterias presentes en el material vegetal fermentan la materia provocando una disminución del pH y del O₂. Es habitual añadir aditivos para facilitar el proceso y asegurarse que no crezcan mohos o levaduras que rompen la anaerobiosis necesaria para la buena fermentación del ensilado (Amado et al., 2012). El objetivo es mantener un pH lo bastante ácido para dificultar el crecimiento de estos microorganismos y permitir la fermentación láctica. En el ensilado se pueden producir dos tipos de fermentaciones: la fermentación láctica y la fermentación butírica. La fermentación láctica es la deseada por su producción de ácido acético, propiónico y láctico. Esta fermentación se realiza en anaerobiosis, con una humedad moderada y acaba con un pH inferior a 4,2. La fermentación butírica se produce con un pH superior a 4,2 y resulta en la producción de ácido butírico y NH3, y es totalmente indeseable (Okoye et al., 2023). Además, la presencia de Listeria en el ensilado se relaciona frecuentemente con un pH superior a 4,5, junto con la presencia de oxígeno.

Estudios previos han demostrado que L. monocytogenes requiere valores de pH superiores a 4,5 (Conner et al., 1990) aunque Akritidou et al., (2022) demostraron que algunas cepas sobrevivieron a valores de pH inferiores a 4,0. Estudios sobre la prevalencia de L. monocytogenes en la leche de 98 explotaciones lecheras de España comprobaron la relación entre la presencia de Listeria spp. en ensilaje y la baja calidad del ensilado (pH alto) (Vilar et al., 2007). Este estudio mostró como los ensilados con pH igual o superior a 4,5 tenían más L. monocytogenes que los ensilados con pH más bajo (29,5 vs. 6,2%, respectivamente).

El crecimiento de L. monocytogenes se ve impedido por un bajo pH, no obstante, esta bacteria puede multiplicarse en partes del ensilado donde el oxígeno no se excluye adecuadamente o en otras expuestas a la infiltración de oxígeno. Además, es importante recalcar que las pocas cantidades de L. monocytogenes que sobreviven al ensilaje podrían experimentar un aumento de crecimiento si el pH aumenta más allá de 4,5 después de la apertura del ensilado (Queiroz et al., 2018). Por eso este patógeno puede encontrarse en ensilados empacados, debido a su densidad relativamente baja, pH alto, alta relación superficie-masa y presencia de bolsas aeróbicas debido al daño de los plásticos o al número insuficiente de capas de plástico en el ensilaje empacado (Nucera et al., 2016; Queiroz et al., 2018). Además, es importante destacar que, al contario de otros patógenos, unas condiciones de humedad baja no inhiben el crecimiento de L. monocytogenes en los ensilados (Queiroz et al., 2018).

La adición de ácidos, probióticos o bacteriocinas en el ensilaje pueden ayudar a mejorar la seguridad del ensilado, así como la fermentación, la recuperación de nutrientes, la calidad y la vida útil del ensilado, mejorando el proceso de acidificación del ensilado y estabilizando la flora deseada (Queiroz et al., 2018). A continuación, describimos las estrategias más comunes para asegurar la estabilidad del pH y la conservación de la anaerobiosis:

1. Para minimizar la entrada de oxígeno, es preciso disminuir al máximo la ratio superficie/volumen del ensilado.
2. Siguiendo el objetivo de reducir la superficie del ensilado expuesta al oxígeno, puede ser necesario tallar el embalado para conseguir caras lo más planas posibles.
3. El ritmo de distribución del ensilado debe de adaptarse al modo de almacenamiento del ensilado para mitigar la exposición al aire de la cara expuesta. Para un ensilado almacenado en torre, se calcula un ritmo de 5 a 10 cm/día; en silo Bunker, se estima un ritmo de 10 a 15 cm/día, y finalmente en las bolsas se recomienda distribuir más de 30 cm/día (Muck et al., 2018). Estas estimaciones dependen del clima, el calor y la humedad, de forma que, en países tropicales, la cantidad distribuida debe de superar los 30 cm al día (Whitlow & Hagler, 2001).

Entre todos los tipos de aditivos del ensilado que existen, en este artículo nos centraremos en los probióticos y las moléculas bactericidas que producen y liberan: las bacteriocinas. Algunos probióticos tienen una gran ventaja en comparación con los demás aditivos: participan en la fermentación láctica del ensilado. Por lo tanto, contribuyen en la bajada rápida del pH y en la estabilidad del ensilado además de mejorar el rendimiento productivo de los animales por un mejor aprovechamiento del vegetal fermentado (Muck et al., 2018; Okoye et al., 2023). Por ejemplo, el ácido láctico producido por las cepas de Lactobacillus spp., y más específicamente L. plantarum, disminuye el crecimiento de L. monocytogenes (Okoye et al., 2023; Queiroz et al., 2018). Las cepas usadas como probióticos se seleccionan cuidadosamente y cumplen requisitos muy definidos como, por ejemplo, la producción suficiente de ácidos orgánicos, un crecimiento adecuado en un amplio rango de pH o temperatura, compatibilidad con otras cepas y la capacidad de inhibición de patógenos. Gracias a los avances científicos de los últimos años, se puede mejorar y diseñar nuevas cepas probióticas para que se adapten mejor al tipo de ensilado diana e incrementar su rendimiento (Okoye et al., 2023). Se distinguen dos categorías de bacterias: las cepas homofermentativas y las heterofermentativas. Las homofermentativas son las más antiguas y comunes, generalmente usadas en ensilados de legumbres. L. plantarum es un representante muy usado de esta categoría que incluye también cepas de los géneros Pediococcus, Streptococcus y Enterococcus. Las cepas heterofermentativas incluyen a los géneros Leuconostoc, Oenococcus, Weissella y Lactobacillus. Estas cepas se diferencian de las anteriores por una mayor producción de compuestos secundarios, a parte del ácido láctico, como es el ácido acético, el etanol y el CO₂ (Okoye et al., 2023).

Otra estrategia interesante consiste en combinar varias bacterias a la hora de diseñar un aditivo biológico, puesto que existen efectos sinérgicos entre las cepas (Okoye et al., 2023). Un buen ejemplo es la mezcla de L. plantarum, Lactococcus lactis y Pediococcus acidilactici (Amado et al., 2012). Al inocular un ensilado de ray-grass con esta combinación de bacterias, el pH alcanza un valor inferior a 4 en solo dos días, lo que desencadena la liberación de nisina por L. lactis y de pediocina por P. acidilactici. Estas dos bacteriocinas presentan mayor letalidad a un pH de 3.5, por lo que el papel de L. plantarum en la acidificación del ensilado es fundamental tanto para la excreción de las bacteriocinas como para su máxima eficacia a la hora de matar a L. monocytogenes (Queiroz et al 2018). En general, combinar cepas homofermentativas con cepas heterofermentativas permite asegurar la disminución rápida del pH al formar el silo, impidiendo el consumo del ácido láctico por los mohos y levaduras. La combinación más clásica es la de Lentilactobacillus buchneri con una cepa convencional homofermentativa, pero existen muchas más opciones, dependiendo de los objetivos específicos y de la materia prima (Okoye et al., 2023).

Las bacteriocinas también son empleadas para el control de Listeria, y son aún más relevantes cuando se sabe que, aunque el pH del ensilado sea bajo, Listeria puede seguir siendo capaz de crecer (Amado et al., 2012). El uso de bacteriocinas puras requiere una clasificación y aprobación como aditivo. En cambio, usar cepas productoras de bacteriocinas como starters no requiere una aprobación, por lo tanto, es la vía más rápida para su uso, facilitando la selección de bacterias probióticas como herramienta para controlar patógenos (Deegan et al., 2006). Un ejemplo interesante es la bovicina HC5 liberada por una cepa frecuentemente empleada como probiótico: Streptococcus bovis. Esta bacteriocina provoca la caída del pH intracelular de Listeria conduciendo a su muerte después de 2h. Otro ejemplo de bacteriocina es la enterocina 99 la cual fue aislada de un ensilado, siendo letal para L. monocytogenes y es producida por Enterococcus faecium, una bacteria usada como probiótico (Queiroz et al., 2018).

Las bacteriocinas o bacterias probióticas que las producen se han estudiado en ensilados y se ha confirmado que facilitan el control de L. monocytogenes (Queiroz et al., 2018). Sería interesante realizar más estudios en el futuro para analizar el impacto de estos probióticos en el rendimiento y la salud de los animales. Se ha demostrado que las bacterias productoras de ácido láctico son eficaces para eliminar Listeria. Hay dos mecanismos implicados: por un lado, la reducción del pH que estas bacterias producen durante la fermentación, creando condiciones poco favorables a la reproducción del patógeno y, por otro lado, la producción de bacteriocinas por cepas tales como E. faecium y Lactobacillus spp., que provocan la muerte de L. monocytogenes. Estos probióticos compiten también con los mohos y las levaduras, por lo que se está estudiando su papel como reguladores de estos agentes (Amado et al., 2012; Okoye et al., 2023; Queiroz et al., 2018). Además, existe una sinergia entre los diferentes antimicrobianos que permite cubrir los riesgos y evitar la aparición de resistencias. Por todo ello, enfocarse en las combinaciones entre cepas probióticas parece ser una buena estrategia para mejorar el control de la listeriosis.

El Grupo de Investigación Patógenos Intracelulares: Biología e Infección ha contado con financiación de la Generalitat Valenciana (AICO/2021/278), del Ministerio de Ciencia e Innovación de España (PID2022-137961OB-I00) y de la Universidad CEU Cardenal Herrera de Valencia (INDI 22/44). J.J. Quereda y A. Gómez cuentan con el apoyo de un contrato “Ramón y Cajal” del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades de España (RYC-2018-024985-I, RYC2021-032245-I). Y. Markovich, A. Espí, J. Poujol de Molliens y M. Palanca disfrutan de un contrato predoctoral de la Universidad CEU Cardenal Herrera. Finalmente queremos agradecer la colaboración de las explotaciones de vacuno, ovino y caprino que colaboran con esta línea de investigación.

Referencias bibliográficas

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