Evaluación de una nueva estrategia para el diagnóstico humoral de la paratuberculosis caprina

La paratuberculosis (PTB) es una enfermedad con un gran impacto sanitario y económico en el ganado caprino y cuyo diagnóstico supone un gran desafío en la actualidad debido, entre otros factores, a la limitada capacidad de todas las técnicas ante-mortem disponibles para detectar la infección. Sin embargo, recientemente se ha evaluado una nueva estrategia diagnóstica que podría mejorar el diagnóstico humoral de la enfermedad en caprinos empleando muestras de suero o leche.

Las infecciones micobacterianas como la PTB y la tuberculosis (TB), representan una grave amenaza para la sanidad animal, economía y bienestar animal de los rebaños caprinos en todo el mundo (Pesciaroli et al., 2014; Windsor, 2015). La PTB, también conocida como enfermedad de Johne, es una enteritis granulomatosa crónica causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), que afecta principalmente a rumiantes domésticos y silvestres (Windsor, 2015). Además, se ha sugerido que MAP pueda estar relacionado con la enfermedad de Crohn, causando enfermedad inflamatoria intestinal en las personas (Chamberlin et al., 2001; Feller et al., 2007). La PTB en cabras se manifiesta con pérdida de peso progresiva, reducción en la producción láctea, trastornos reproductivos y aumento en las tasas de mortalidad en los rebaños (Stonos et al., 2017; Windsor, 2015). La infección por MAP generalmente se produce por contacto directo con la bacteria a una edad temprana, a través de la ingestión de las micobacterias en calostro contaminado, pienso, agua o incluso en el medio ambiente (Jiménez-Martín et al., 2022; Windsor, 2015), pero también se encuentra descrita la posibilidad de transmisión transplacentaria durante la gestación (Whittington & Windsor, 2009). Los animales infectados con MAP suelen permanecer infectados de forma sub-clínica durante años antes de presentar sintomatología. Durante este periodo, pueden estar eliminando la bacteria incluso antes de desarrollar una respuesta inmune detectable en las pruebas diagnósticas, propagando así la enfermedad y dificultando su control (Lybeck et al., 2011). A pesar del impacto sanitario y económico de la enfermedad en la cabaña ganadera, en España no hay implantados programas específicos de erradicación de PTB. Por este motivo, el control de la enfermedad se realiza a través de estrategias de diagnóstico, prevención y vacunación contra la enfermedad, estando esta última permitida y extendida entre los rebaños caprinos en España, y llevado a cabo de manera voluntaria por parte de los ganaderos, quienes asumen los costes (Espinosa et al., 2021; Juste & Perez, 2011; Pérez De Val et al., 2012).

Actualmente, las pruebas diagnósticas ante-mortem de PTB en cabras se basan en la detección de MAP mediante PCR o mediante cultivo bacteriológico en muestras de heces (Sevilla et al., 2014; Wells et al., 2006; Windsor, 2015), el cual tradicionalmente se ha considerado la técnica de referencia para el diagnóstico de PTB (Stabel, 1997). Sin embargo, este método no se encuentra exento de limitaciones como el lento crecimiento de MAP (de hasta 6 meses) (Nielsen & Toft, 2008), el elevado coste y la limitada sensibilidad de la técnica (Whittington et al., 2000), especialmente en animales infectados sub-clínicamente (Nielsen & Toft, 2008) debida, entre otros factores, a la excreción intermitente de MAP en heces (Paolicchi et al., 2003; Tiwari et al., 2006).

Por este motivo, en los últimos años se han evaluado metodologías diagnósticas basadas en la detección de anticuerpos como las técnicas ELISA empleando muestras de suero o leche, debido al menor coste y a la mayor rapidez en la obtención de resultados con respecto al cultivo microbiológico (Nielsen & Toft, 2008). Sin embargo, estas técnicas tampoco están exentas de limitaciones como por ejemplo, su menor capacidad para detectar animales infectados de PTB (sensibilidad) en fases iniciales de la enfermedad y aumentando así la posibilidad de obtener resultados falsos negativos (Nielsen & Toft, 2008; Whittington et al., 2000). En este sentido, un estudio realizado en cabras por Salgado y colaboradores (Salgado et al., 2007), atribuyó una sensibilidad a la técnica ELISA del 74,3% en muestras de suero y del 60,0% en leche. Además, MAP comparte numerosos antígenos y proteínas con otras micobacterias, incluyendo los agentes etiológicos de la TB caprina (Gilot & Cocito, 1993; Pitulle et al., 1992). Por este motivo, aunque generalmente se ha atribuido una elevada especificidad al ELISA tanto en muestras de suero como leche (Salgado et al., 2007, Nielsen & Toft, 2008), la especificidad de la técnica puede verse mermada en determinados contextos epidemiológicos (Didkowska et al., 2021).

La TB caprina es una zoonosis causada por micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) y sometida a programas de erradicación en diversas regiones en nuestro país, basados principalmente en una estrategia de diagnóstico y sacrificio de los animales reactores a la prueba de la intradermotuberculinización simple (IDTBs) o comparada (IDTBc). En un estudio reciente, se observó un aumento en el título de anticuerpos en suero y leche en caprinos infectados de TB tras la realización de una IDTBc (efecto booster), mejorando la sensibilidad del diagnóstico humoral de TB en esta especie (Ortega et al., 2022). Empleando una aproximación similar, el objetivo de la presente investigación fue evaluar el efecto booster de una IDTBc en la respuesta humoral frente a MAP en muestras de suero y leche en ganado caprino, para evaluar su utilidad como una potencial estrategia diagnóstica que maximice la sensibilidad de las técnicas humorales de PTB y, por tanto, la detección de animales infectados de PTB.

Inicialmente los animales fueron sometidos a una IDTBc (día 0 del estudio). La IDTBc fue realizada acorde con la normativa vigente [Reglamento (UE) 2016/429] y los protocolos recomendados por el Laboratorio Europeo de Referencia (EU-RL) de TB bovina para la realización de la prueba de la IDTB en cabras (SOP/002/EURL; https://www.visavet.es/bovinetuberculosis/databases/protocols.php). Además, tanto ese mismo día 0 (antes de realizar la IDTBc) como posteriormente en los días 3 (día de lectura de la IDTBc), 15, 30 y 60 tras la IDTBc se recogieron muestras de suero y leche de los animales para la detección de IgG anti-MAP mediante un kit comercial de ELISA indirecto (ID Screen Paratuberculosis Indirect screening test; Innovative Diagnostics, Grabels, Francia). El kit ELISA incluía un paso previo de pre-adsorción con un extracto de Mycobacterium phlei para reducir la reactividad cruzada por una posible exposición previa a micobacterias ambientales (Yokomizo, 1985). Los resultados fueron interpretados siguiendo las recomendaciones del fabricante: Los animales fueron considerados positivos con un resultado de ELISA (S/P%) mayor al 70% en muestras de suero y mayor al 30% en leche.

Las diferencias en los resultados del ELISA entre los diferentes días muestreados y entre diferentes tipos de muestras (suero y leche) se analizaron tanto a nivel cualitativo (número de cabras positivas al ELISA) como a nivel cuantitativo (valores S/P%). Todos los análisis estadísticos fueron realizados con el software estadístico comercial SPSS 27 (IBM, Nueva York, NY, EE.UU.) y se consideró un valor de p de 0.05 como estadísticamente significativo.

Con respecto a los resultados cuantitativos (S/P%), no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el día 3 tras la IDTBc, independientemente de la muestra analizada. Posteriormente, se observó un aumento significativo (p < 0,001) en los valores de S/P% (efecto booster) en el día 30 en comparación con el día 0 cuando se utilizaron muestras de suero. En el caso de la leche, el efecto booster asociado a la IDTBc se observó de forma más temprana, con diferencias significativas (p < 0,001) en los valores de S/P% en el día 15 del estudio que se mantuvieron hasta el día 30 tras la IDTBc en comparación con el día 0 del estudio (Tabla 1). Después del día 30, se observó una disminución en los resultados de S/P% para ambas muestras, hasta valores similares registrados en el día 0 del estudio. De forma similar a lo descrito en estudios experimentales realizados en cabras infectadas de TB en los que la IDTB provocó un efecto booster en la respuesta humoral frente a la TB, el incremento en la respuesta cuantitativa observada en el ELISA (S/P%) en suero y leche en el presente estudio se atribuyó a un incremento en el título de anticuerpos frente a MAP a consecuencia de la IDTB (Casal et al., 2014; Gutiérrez et al., 1998; A. E. Kennedy et al., 2017; Ortega et al., 2022; Waters et al., 2015). Sin embargo, este incremento en la respuesta cuantitativa no se tradujo en un aumento significativo en el número de reactores al ELISA incluso al utilizar puntos de corte más estrictos (datos no mostrados), aunque no se podría descartar en otras situaciones epidemiológicas con mayor prevalencia de PTB o en otras especies animales. En este sentido, en estudios previos realizados en ganado bovino se observó un efecto booster en el título de anticuerpos cuantificado mediante una técnica ELISA en muestras de suero y leche en rebaños infectados de PTB (Kennedy et al., 2014; Nunney et al., 2022). En el estudio realizado por Kennedy y colaboradores (Kennedy et al., 2014) se describió un aumento significativo en el número de animales positivos a una técnica ELISA en los días 14 y 9 post-IDTBc en muestras de suero y leche, respectivamente, lo que podría indicar un efecto booster más temprano en leche con respecto a suero en comparación a lo observado en el presente estudio. Además, en el estudio de Kennedy y colaboradores (Kennedy et al., 2014), el número de vacas positivas en el ELISA empleando muestras de suero fue significativamente mayor hasta el día 58 tras la IDTBc con respecto al día inicial del estudio, en comparación con el día 30 post-IDTBc observado en nuestro estudio. Sin embargo, esta reactividad en el ELISA más marcada y duradera podría estar asociada a una diferente reactividad entre bovinos y caprinos o a encontrarse en diferentes fases de la enfermedad, entre otros factores.

Respecto al tipo de muestra analizada en nuestro estudio, el número de cabras positivas al ELISA fue significativamente mayor (p < 0,005) en todos los días muestreados cuando se emplearon muestras de suero en comparación con muestras de leche. Este hecho sugiere una mayor capacidad de la técnica para detectar individuos infectados (sensibilidad) cuando se emplean muestra de suero. De hecho, en un estudio realizado por Salgado y colaboradores (Salgado et al., 2007) también se observó una mayor sensibilidad de la técnica ELISA cuando se utilizaban muestras de suero en comparación con muestras de leche, empleando el cultivo fecal como prueba de referencia. Las diferentes sensibilidades observadas en suero y leche pueden deberse a diferencias en los títulos de IgG entre distintos tipos de muestra que detecta la técnica ELISA. En este sentido, en un estudio previo se observaron diferencias en los títulos de IgG entre distintos tipos de muestras, como suero, leche o calostro (Lacoste et al., 2023), pudiendo este hecho afectar a la sensibilidad de las técnicas humorales de PTB. Además, en estudios previos realizados en ganado bovino infectado de PTB se ha observado un mayor título de anticuerpos frente a MAP en muestras de leche en etapas tempranas y, sobre todo, en etapas tardías de la lactación y, por lo tanto, una mayor sensibilidad del ELISA en este período. Por el contrario, en etapas intermedias de la lactación en la que hay una mayor producción lechera, se ha descrito una menor sensibilidad de la técnica ELISA en leche por un posible efecto de dilución de la muestra (Nielsen et al., 2002a; Nielsen et al., 2002b). Por este motivo, considerando que las cabras incluidas en nuestro estudio se encontraban en una fase intermedia de lactación, no se puede descartar un efecto negativo sobre la sensibilidad del ELISA en muestras de leche observada en el presente estudio.

No obstante, teniendo en cuenta el sub-grupo de animales que fueron positivos en el ELISA en el día 0 del estudio (Figura 2A), no se observaron diferencias significativas en los valores de S/P% observados entre las muestras de suero y leche en ninguno de los días muestreados. Este hallazgo podría estar relacionado con los altos valores de S/P% observados de inicio en estos animales. Sin embargo, en el grupo de cabras negativas al ELISA en el día 0, se observaron valores significativamente más altos de S/P% (p < 0,001) en las muestras de suero y leche tomadas en los días 15 y 30 tras la IDTBc (Figura 2B), en línea con los resultados observados en el conjunto total de animales. Esto último podría llevarnos a pensar que el efecto de la IDTBc sobre el ELISA de PTB pueda estar relacionado con una pérdida significativa de especificidad. En este sentido, estudios previos realizados en ganado bovino libre de TB con el objetivo de caracterizar el efecto de una IDTBc reciente sobre el diagnóstico humoral de PTB en rebaños libres, observaron un aumento en la aparición de animales falsos positivos al ELISA en suero (Varges et al., 2009) y leche (Nunney et al., 2022). No obstante, la alta incidencia de PTB en el ganado caprino en España (Jiménez-Martín et al., 2022), la dificultad para encontrar rebaños caprinos históricamente libres de PTB o que no vacunen frente a la enfermedad (Juste & Perez, 2011), así como la limitada capacidad de las técnicas ante-mortem de PTB para detectar la infección (Nielsen & Toft, 2008), dificultan la posibilidad de realizar estudios detallados sobre el impacto de una IDTBc en la especificidad del ELISA. Sin embargo, dado que en nuestro estudio fue confirmada la presencia de MAP en el rebaño y es bien conocida la limitada capacidad de las técnicas humorales de PTB para detectar animales infectados (Nielsen & Toft, 2008; Whitlock et al., 2000), es probable que hubiera un mayor número de cabras infectadas de PTB que el estimado de inicio con la técnica ELISA y, por lo tanto, el aumento en el número de reactores observado tras realizar la IDTBc estuviera asociado con un aumento en la detección de cabras infectadas. No obstante, la imposibilidad de sacrificio de los animales del estudio y realización de análisis post-mortem que permitan confirmar la infección de PTB, dificulta la interpretación de los resultados y sería recomendable la realización de más estudios en rebaños caprinos bajo diferentes condiciones epidemiológicas que permitan dilucidar si el uso complementario de ambas técnicas diagnósticas (IDTBc y ELISA de PTB) puede maximizar la detección de caprinos infectados de PTB.

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