Análisis de asociación de genoma completo de caracteres relacionados con el perfil hematológico de cabras de la raza Murciano-Granadina

El hemograma constituye una importante herramienta de estudio sobre el estado de salud de los animales. Por lo tanto, los estudios de asociación de genoma completo y las pruebas basadas en información genómica permiten realizar selección de los mejores animales. En el caso de la raza Murciano-Granadina, se han detectado varias regiones genómicas asociadas a parámetros del recuento de glóbulos rojos y leucocitos en cabras.

El hemograma constituye una importante herramienta de estudio sobre el estado de salud de los animales (Medina & Custodio, 2013). Las células sanguíneas pueden clasificarse en dos poblaciones fundamentales: los glóbulos rojos (GR), que regulan el transporte de oxígeno y hierro y facilitan la hemostasia (Astle et al., 2016), y los glóbulos blancos (GB), que intervienen en la inmunidad adquirida e innata, así como en el desarrollo de respuestas alérgicas e inflamatorias (Buttari et al., 2015). Los neutrófilos (NE) son los glóbulos blancos más numerosos, y tienen un papel destacado en la eliminación de patógenos a través de una variedad de mecanismos que incluyen la desgranulación, la fagocitosis y la amplificación de la inflamación (Janeway et al., 2001). Los eosinófilos (EO), junto con los mastocitos y los basófilos, controlan mecanismos asociados a alergias (Janeway et al., 2001). Los monocitos (MO) son producidos por la médula ósea y liberados al torrente sanguíneo para llegar a los focos de infección, aumentando de tamaño y convirtiéndose en macrófagos capaces de engullir y digerir patógenos (Janeway et al., 2001). Por último, los linfocitos B y T son los principales efectores de la inmunidad adaptativa. Los linfocitos B expresan receptores de inmunoglobulina de superficie que pueden reconocer epítopos de antígenos específicos y participan en la respuesta inmunitaria humoral, mientras que, en el timo, los linfocitos T maduran hasta convertirse en linfocitos T auxiliares y citotóxicos, que son los principales responsables de la inmunidad mediada por células (Janeway et al., 2001).

El análisis de estos parámetros y de sus desviaciones permite conocer las anomalías que pueden afectar a los órganos (Couto Hack, 2010). Tal es así que los índices hematológicos, o biometría hemática, se emplean habitualmente para determinar el estado de salud y como una herramienta básica de diagnóstico (Gonzalez et al., 2013).

Los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) y las pruebas basadas en información genómica permiten realizar selección de los mejores animales y aumentar la eficiencia de cría de los mismos a través la asociación entre genes y de una gran cantidad de marcadores tipo SNP distribuidos en el genoma (Zhang et al., 2013).

La base genética de los parámetros hematológicos no se había explorado hasta el momento en cabras. En el presente trabajo, nos propusimos llenar este vacío mediante la realización de un estudio de asociación genómica (GWAS) para 12 parámetros hematológicos registrados en 882 cabras Murciano-Granadina.

Ejemplares de la raza Murciano-Granadina.

Se recogieron muestras de sangre de 882 cabras hembras de raza Murciano-Granadina (MG) distribuidas en 11 explotaciones intensivas y 3 semiintensivas de pequeño tamaño ubicadas en la provincia de Granada (España). Todos los animales muestreados están inscritos en la Asociación Nacional de Ganado Caprino de Raza Murciano-Granadina (Caprigran).

Mediante un analizador hematológico automatizado Abbott Cell-Dyn 3700 (Laboratorio GMI. Ramsey, EE.UU.), en el Laboratorio Veterinario Garfia SL (https://laboratorioveterinario.vet/) se realizaron las mediciones de los siguientes parámetros hematológicos: hematíes (GB) hemoglobina (HCT), hematocrito (HGB), volumen corpuscular medio (VCM), amplitud de distribución eritrocitaria (RDW), hemoglobina corpuscular media (HCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), leucocitos (GB), linfocitos (LYM), neutrófilos (NE) monocitos (MO) y eosinófilos (EO).

Se extrajo ADN de las muestras mediante el método de fenol-cloroformo. Las muestras de ADN genómico se genotipificaron con el Illumina GoatSNP50 BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este chip contiene 54.241 SNPs distribuidos uniformemente por el genoma caprino con un espaciado medio entre SNPs de aproximadamente 40 kb (Tosser-Klopp et al., 2014). Las ubicaciones genómicas de los SNP y los archivos de clúster fueron proporcionadas por el Consorcio Internacional del Genoma Caprino (http://www.goatgenome.org/). Los procedimientos estándar de control de calidad del genotipo de SNPs se realizaron con PLINK v 1.9 (Chang et al., 2015). Se filtraron los marcadores con un “call rate ”inferior a 0,90, frecuencia de alelos menores (MAF) inferior a 0,05, con un mapeo de cromosomas sexuales o genotipos que se desviaron significativamente del equilibrio de Hardy Weinberg (P < 0,001). Además, también se excluyeron los individuos con una ‘call rate’ de genotipo inferior al 95%.

El análisis de asociación se realizó con el paquete ‘Genome-wide Efficient Mixed-Model Association’ (GEMMA) v 0.98.1 (Zhou & Stephens, 2012) ajustando el modelo mixto lineal univariado por cada carácter.

y=Wα+xβ+u+ε

Los valores P obtenidos en cada asociación se corrigieron para múltiples pruebas utilizando el método del ‘False Discovery Rate’ (FDR) (Benjamini & Hochberg, 1995). Los Manhattan plots se construyeron con el paquete R ‘qqman’ (R Core Team, 2017). Los genes ubicados ± 1 Mb alrededor de los SNPS significativos se recuperaron utilizando la herramienta Biomart de Ensembl (Kinsella et al., 2011) y posteriormente se analizaron con Uniprot (UniProt Consortium, 2019) para anotar sus funciones biológicas.

Tras realizar el GWAS, detectamos 3 SNP que mostraban asociaciones significativas a nivel genómico con algunos parámetros sanguíneos. El SNP rs268273004, localizado en el cromosoma caprino CHI21 mostró asociaciones significativas con HCM, CHCM, HCT y VCM, el SNP rs268272996, también mapeado en el cromosoma CHI21, se asoció significativamente con HCM, y el tercer SNP (rs268239059) localizado CHI13 se asoció significativamente con HCT (Tabla 1; Figura 1).

Tabla 1. Asociaciones significativas a nivel genómico entre marcadores SNP y parámetros sanguíneos registrados en 882 cabras Murciano-Granadina.

¹ Carácter, HCT: hematocrito; CHCM, concentración de hemoglobina corpuscular media; HCM, hemoglobina corpuscular media; VCM, volumen corpuscular medio; ² Chr, cromosoma; ³ rs, código identificador del SNP según la base de datos RefSNP; ⁴ Pos, posición en pares de bases; ⁵ A1, alelo menor; ⁶ MAF, frecuencia alélica menor; ⁷ P-valores, P-valores en bruto.

Figura 1. Ejemplo de diagramas de Manhattan del estudio GWAS, que muestra los resultados de los SNP asociados con HCT y MCH.

Dos de los tres SNP mencionados anteriormente están situados muy cerca del gen del Grupo I de Complementación FA (FANCI). Esta molécula participa en la reparación del ADN y su inactivación conduce a la anemia de Fanconi, un síndrome caracterizado por una insuficiencia de la médula ósea, anemia aplásica y trastornos congénitos. Las mutaciones en este gen pueden causar anemia de Fanconi (Savage et al., 2015), un síndrome hereditario caracterizado por insuficiencia de la médula ósea, anemia aplásica y trastornos congénitos (Sondalle et al., 2019). Los ratones knockout para el gen FANCI muestran defectos hematopoyéticos, así como enanismo y microftalmia, con parecido a los síntomas típicos de la anemia de Fanconi (Dubois et al., 2019). Además, los pacientes con anemia de Fanconi muestran alteraciones del citoesqueleto y del estado redox de los eritrocitos (Malorni et al., 2000). Nuestra hipótesis es que cerca o dentro del gen FANCI de la cabra podría haber al menos una mutación causal con efectos pleiotrópicos sobre diversos rasgos de los eritrocitos pero que no conduce a ninguna patología observable. De hecho, Tomaszowski et al. (2020) señalaron que los knock-outs homocigotos para genes FANCI individuales sólo muestran fenotipos de enfermedad leves y selectivos en lugar del repertorio completo de síntomas de la anemia de Fanconi, sugiriendo así que se requiere la inactivación génica poligénica para la manifestación de la enfermedad.

Por otra parte, sin entrar en los detalles, se han encontrado 44 asociaciones significativas a nivel cromosómico para diversos parámetros sanguíneos, identificando varios genes candidatos involucrados en la fisiología y el metabolismo de los eritrocitos, así como en la inmunidad.

La descripción de los genes es útil para comprender cómo la presencia de estos determinantes genéticos puede regular positivamente la variación fenotípica de los propios caracteres hematológicos afectando a la salud de los animales.

En resumen, hemos detectado varias regiones genómicas asociadas a parámetros del recuento de glóbulos rojos y leucocitos en cabras. El resultado más prometedor es la asociación significativa a nivel genómico entre varios fenotipos de glóbulos rojos y un marcador genético en el cromosoma 21 (rs268273004). Este marcador mapea cerca del gen FANCI, que codifica una proteína de reparación del ADN implicada en la anemia de Fanconi. La identificación de estas regiones puede considerarse como un primer paso hacia la detección de mutaciones con efectos causales sobre un conjunto de fenotipos estrechamente relacionados con la inmunidad, la susceptibilidad a enfermedades y el bienestar animal.

Bibliografía

• Astle, W. J., Elding, H., Jiang T., Allen, D., Ruklisa, D., Mann, A. L., Mead D., Bouman, H., Riveros-Mckay, F., Kostadima, M. A., Lambourne, J. J., Sivapalaratnam, S., Downes, K., Kundu, K., Bomba, L., Berentsen, K., Bradley, J. R., Daugherty, L. C., Delaneau, O., Freson, K., Garner, S. F., Grassi, L., Guerrero, J., Haimel, M., Janssen-Megens, E. M., Kaan, A., Kamat, M., Kim, B., Mandoli, A., Marchini, J., Martens, J. H.A., Meacham, S., Megy, K., O’Connell, J., Petersen, R., Sharifi, N., Sheard, S. M., Staley, J. R., Tuna, S., van der Ent, M. & Walte, K. (2016). The Allelic Landscape of Human Blood Cell Trait Variation and Links to Common Complex Disease. Cell, 167(5), 1415-1429.e19. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.042
• Benjamini, Y., & Hochberg, Y. (1995). Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological), 57(1), 289-300. https://doi.org/10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
• Buttari, B., Profumo, E., & Riganò, R. (2015). Crosstalk between Red Blood Cells and the Immune System and Its Impact on Atherosclerosis. BioMed Research International, 2015, 616834. https://doi.org/10.1155/2015/616834
• Chang, C. C., Chow, C. C., Tellier, L. C., Vattikuti, S., Purcell, S. M., & Lee, J. J. (2015). Second-generation PLINK: Rising to the challenge of larger and richer datasets. GigaScience, 4, 7. https://doi.org/10.1186/s13742-015-0047-8
• Charles A Janeway, J., Travers, P., Walport, M., & Shlomchik, M. J. (2001). The components of the immune system. En Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. Garland Science. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27092/
• Couto Hack, A. K. (2010). Caracterización genética y perfil hematológico y bioquímico en ovinos de raza «Criolla lanada serrana» del Planalto Serrano Catarinense-Santa Catarina, Brasil. https://doi.org/10.18002/10612/827
• Dubois, E. L., Guitton-Sert, L., Béliveau, M., Parmar, K., Chagraoui, J., Vignard, J., Pauty, J., Caron, M.-C., Coulombe, Y., Buisson, R., Jacquet, K., Gamblin, C., Gao, Y., Laprise, P., Lebel, M., Sauvageau, G., D d’Andrea, A., & Masson, J.-Y. (2019). A Fanci knockout mouse model reveals common and distinct functions for FANCI and FANCD2. Nucleic Acids Research, 47(14), 7532-7547. https://doi.org/10.1093/nar/gkz514
• Gonzalez, M. V., Mousel, M. R., Herndon, D. R., Jiang, Y., Dalrymple, B. P., Reynolds, J. O., Johnson, W. C., Herrmann-Hoesing, L. M., & White, S. N. (2013). A Divergent Artiodactyl MYADM-like Repeat Is Associated with Erythrocyte Traits and Weight of Lamb Weaned in Domestic Sheep. PLOS ONE, 8(8), e74700. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0074700
• Kinsella, R. J., Kähäri, A., Haider, S., Zamora, J., Proctor, G., Spudich, G., Almeida-King, J., Staines, D., Derwent, P., Kerhornou, A., Kersey, P., & Flicek, P. (2011). Ensembl BioMarts: A hub for data retrieval across taxonomic space. Database: The Journal of Biological Databases and Curation, 2011, bar030. https://doi.org/10.1093/database/bar030
• Malorni, W., Straface, E., Pagano, G., Monti, D., Zatterale, A., Del Principe, D., Deeva, I. B., Franceschi, C., Masella, R., & Korkina, L. G. (2000). Cytoskeleton alterations of erythrocytes from patients with Fanconi’s anemia. FEBS Letters, 468(2-3), 125-128. https://doi.org/10.1016/s0014-5793(00)01187-x
• Medina, L. E. G., & Custodio, M. Á. C. (2013). Valores hematológicos de cabras criollas en dos estados fisiológicos reproductivos. Scientia Agropecuaria, 4(4), 285-292.
• Savage, S. A., Sumislawski, J. J., Zarzaur, B. L., Dutton, W. P., Croce, M. A., & Fabian, T. C. (2015). The new metric to define large-volume hemorrhage: Results of a prospective study of the critical administration threshold. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery, 78(2), 224-229; discussion 229-230. https://doi.org/10.1097/TA.0000000000000502
• Sondalle, S. B., Longerich, S., Ogawa, L. M., Sung, P., & Baserga, S. J. (2019). Fanconi anemia protein FANCI functions in ribosome biogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(7), 2561-2570. https://doi.org/10.1073/pnas.1811557116
• Tomaszowski, K.-H., Roy, S., Keshvani, C., Ott, M., DiNardo, C., Schindler, D., & Schlacher, K. (2020). Polygenic mutations model the pleiotropic disease of Fanconi Anemia (p. 2020.09.01.277038). bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.09.01.277038
• Tosser-Klopp, G., Bardou, P., Bouchez O., Cabau, C., Crooijmans, R., Dong, Y., Donnadieu-Tonon, C., Eggen, A., Heuven, HCM. & Jamli, S. (2014). Design and characterization of a 52K SNP chip for goats. PloS One, 9(1), e86227. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0086227
• UniProt Consortium. (2019). UniProt: A worldwide hub of protein knowledge. Nucleic Acids Research, 47(D1), D506-D515. https://doi.org/10.1093/nar/gky1049
• Zhang, L., Liu, J., Zhao, F., Ren, H., Xu, L., Lu, J., Zhang, S., Zhang, X., Wei, C., Lu, G., Zheng, Y., & Du, L. (2013). Genome-wide association studies for growth and meat production traits in sheep. PloS One, 8(6), e66569. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066569
• Zhou, X., & Stephens, M. (2012). Genome-wide efficient mixed-model analysis for association studies. Nature Genetics, 44(7), 821-824. https://doi.org/10.1038/ng.2310