Efectos de la preparación de dosis refrigeradas sobre la microbiota de los eyaculados de caprino

Entre las tecnologías de reproducción asistida, la inseminación artificial es la que más se utiliza en las ganaderías comerciales siendo una herramienta imprescindible para que los programas de mejora genética progresen (López-Sebastián et al., 2014). Esta técnica permite establecer de manera eficiente conexiones entre rebaños, permitiendo la evaluación genética de machos y hembras y permite evaluar los sementales en fase de prueba de manera rápida a partir de sus hijas nacidas en diferentes ganaderías gracias a la inseminación. Además, posibilita la difusión de animales genéticamente mejorados en un mayor número de hembras y explotaciones, garantizándose al mismo tiempo desde los centros de inseminación unas condiciones sanitarias óptimas (Leboeuf et al., 2008).

La técnica de inseminación artificial lleva asociadas otras tecnologías reproductivas como son las de extracción, conservación y evaluación de la calidad seminal en los machos, así como la detección o la sincronización de celos en las hembras. De hecho, para maximizar las ventajas de la inseminación y favorecer que un eyaculado se pueda usar sobre un mayor número de hembras, es imprescindible diluir el eyaculado y prolongar la vida útil de los espermatozoides una vez que han sido extraídos. Para ello, se han desarrollado diluyentes seminales y técnicas de conservación que implican una reducción de la temperatura con el objetivo de disminuir la tasa metabólica espermática.

En esta especie, hay un claro predominio del uso del semen refrigerado sobre el congelado, debido a que la fertilidad del semen refrigerado es más elevada. Así, se ha estimado que alrededor del 85% de las inseminaciones en España se realizan con semen refrigerado (Arrébola, 2013). Por su parte, el comercio de las dosis congeladas queda prácticamente restringido a casos en el que el macho haya fallecido o a ganaderías que estén muy alejadas del centro de inseminación.

Los seres vivos se dividen en cinco Reinos (animal, vegetal, fungi, protista y monera) y las bacterias pertenecen a este último. En cada reino se distinguen diferentes Grupos y en cada grupo hay varios Filos (o Divisiones) que agrupan individuos que tienen en común una serie de características. Los niveles taxonómicos siguientes son los de Clase, Orden, Familia, Género y Especie.

Hasta muy recientemente, la presencia de microbios en los eyaculados o en las dosis producidas se estudiaba desde un punto de vista patológico ya que los eyaculados se suponían estériles. Es innegable que la presencia de ciertos microorganismos que se transmiten por vía sexual puede provocar enfermedades en las hembras y que la presencia y el crecimiento de determinadas bacterias durante la conservación de las dosis de semen empeoran la calidad y fertilidad de esas dosis e incluso pueden provocar infecciones en el tracto reproductivo de las hembras (Thibier y Guerin, 2000). De hecho, los machos en los centros de inseminación se someten a chequeos periódicos para descartar que sean portadores de enfermedades que puedan ser transmitidas vía semen. Por otra parte, durante los procesos de extracción y preparación de las dosis seminales se extreman las medidas higiénicas para minimizar la contaminación. Además, para evitar un crecimiento exponencial de bacterias en las dosis de semen, en muchas ocasiones se añaden antibióticos a los diluyentes seminales.

No obstante, estudios recientes que utilizan técnicas avanzadas de secuenciación genética para identificar todos los microorganismos en una muestra (su microbiota), sugieren que los eyaculados, lejos de ser estériles, tienen sus propias comunidades microbianas. Es decir, que no todos los microorganismos que aparecen en los eyaculados son patógenos y no todos ellos provocan enfermedades. En humanos, algunos cambios en la microbiota seminal se asocian con alteraciones de la calidad y de la fertilidad espermática (Altmäe et al., 2019; Koedooder et al., 2019; Lundy et al., 2020).

En el caso concreto del ganado caprino, estudios recientes llevados a cabo por el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) y la Universidad CEU Cardenal Herrera (UCH-CEU) en colaboración con la Asociación de Ganaderos de Caprino de Raza Murciano-Granadina de la Comunidad Valenciana (Amurval) describen por primera vez la microbiota de los eyaculados de caprino y los cambios asociados a la estacionalidad (Mocé et al., 2022) en seis machos del Centro de Sementales del IVIA. Se observaron diferencias notables en la estructura de la comunidad microbiana entre estaciones.

En total se identificaron 24 filos (o grupos) bacterianos, 19 filos en los eyaculados de la época reproductiva y 23 en la temporada no reproductiva. Esto significa que 18 filos se mantuvieron en ambas temporadas mientras que uno de ellos apareció sólo durante la temporada reproductiva y cinco filos sólo durante la temporada no reproductiva. Los filos que aparecieron sólo durante una de las estaciones se observaron como máximo en uno o dos de los animales muestreados. Además, se observó que la composición de las comunidades microbianas era variable entre animales. Los Firmicutes fueron el filo más abundante, pero su presencia osciló entre el 92% y el 9%. Para el filo Fusobacteria, dos machos presentaron proporciones muy superiores al resto (28% para el macho 1 y 55% para el macho 4).

En ambas estaciones los filos dominantes son Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria y Bacteroidetes. Además, en la estación reproductiva también aparece el filo Fusobacteria y en la no reproductiva el filo Cianobacteria (Figura 1).

Estos filos agrupan un número elevado de géneros microbianos. A nivel de Género (o a nivel de Familia cuando el género no podía ser asignado), se identificaron 424 taxones (235 en la estación reproductiva y 346 en la temporada no reproductiva). De estos taxones, sólo mostraban abundancias relativas >1%, nueve géneros y una familia durante la temporada reproductiva y 11 géneros y dos familias durante la temporada no reproductiva. El género dominante en ambas estaciones era Ureaplasma (Figura 2).

Muchos estudios han confirmado que la estacionalidad afecta las características de calidad del semen caprino (Giriboni et al., 2017), pero se desconoce cómo pueden afectar estos cambios en la microbiota entre estaciones a la calidad espermática y a la fertilidad en caprino. En porcino, la microbiota del semen en los verracos difiere entre verano e invierno y se ha observado que la mayor presencia del género Lactobacillus en muestras invernales se asocia positivamente con la calidad del esperma y el rendimiento reproductivo, y la mayor presencia del género Pseudomonas en muestras de verano se asocia negativamente con la calidad del esperma y el potencial reproductivo (Zhang et al., 2020). Quizás en el futuro se consigan identificar determinados géneros bacterianos cuya presencia en los eyaculados se correlacione con una mayor calidad espermática y tasa de fertilidad y se puedan cultivar para ser añadidas a los diluyentes seminales con el objetivo de mejorar la calidad de las dosis de inseminación en caprino.

Las diferencias observadas en la microbiota entre estaciones en las que la calidad espermática es diferente, nos hizo preguntarnos qué ocurría con la estructura microbiana del eyaculado cuando preparábamos las dosis seminales, ¿se modificaría?

A lo largo del tiempo, se han desarrollado diluyentes y protocolos de conservación seminal para maximizar los beneficios de la inseminación artificial. El objetivo de todos estos procesos es incrementar el volumen del eyaculado para poder usarlo sobre un mayor número de hembras a la vez que mantener la calidad y fertilidad de los espermatozoides durante periodos más largos de los que se conseguiría mantener si no se diluyese el eyaculado. Para prolongar el tiempo de conservación de los espermatozoides es necesario reducir su actividad metabólica y la forma más sencilla de conseguirlo es reduciendo la temperatura de conservación por debajo de la temperatura fisiológica. Por ello, es común que las dosis refrigeradas se conserven a temperaturas por debajo de 17 °C en cualquier especie, siendo 4-5 °C la temperatura de conservación más habitual en caprino.

Los diluyentes son soluciones líquidas que contienen nutrientes, sales, antibióticos y otros componentes esenciales para la supervivencia del espermatozoide. En el caso del ganado caprino es habitual el uso de diluyentes a base de leche, yema de huevo o lecitina de soja, compuestos que protegen a los espermatozoides a las temperaturas de refrigeración comúnmente usadas (4-5 °C).

Aunque estas temperaturas de conservación son muy eficaces para reducir el metabolismo, no son inocuas ni para los espermatozoides ni para algunas bacterias. Se han realizado muchos estudios para determinar cómo afectan distintos diluyentes a la calidad de los espermatozoides refrigerados, y en todos ellos se observa que la calidad espermática se deteriora conforme mayor es el tiempo de conservación de las dosis a 4 °C. No obstante, se ha dado poca importancia a otros aspectos del ambiente extracelular en el que se encuentran los espermatozoides. Por ejemplo, no había ningún estudio en el que se determinase si este proceso de preparación de dosis tiene también implicaciones sobre la microbiota de los eyaculados de partida ya que el eyaculado es diluido y posteriormente enfriado hasta 4 °C para su conservación.

Este mismo año, se ha publicado un estudio llevado a cabo por el IVIA y la UCH-CEU en colaboración con Amurval en el que se ha puesto de manifiesto que la preparación de las dosis de semen y su posterior conservación durante 24 horas provocan cambios significativos en la estructura de comunidades bacterianas del semen de macho cabrío y estos cambios se deben, principalmente, a la dilución de semen con el diluyente que nosotros utilizamos a base de leche desnatada. Además, el almacenamiento de semen a 4 °C durante 24 h también provoca cambios en la composición bacteriana de las dosis de semen (Mocé et al., 2023).

A nivel de Filo (Figura 3) se detectaron 24 filos en los eyaculados originales, 21 en el semen diluido, 24 en el refrigerado y 23 tras su conservación en refrigeración durante 24 h. Al final del proceso, de los 24 filos presentes en los eyaculados siete habían desaparecido y aparecieron seis nuevos. Dos de estos seis filos fueron detectados por primera vez después de la dilución (Bdellovibrionota y Dependentiae), otro cuando las dosis de semen alcanzaron los 4 °C (enfriado 0 h) y los otros tres después de que el semen hubiera sido refrigerado durante 24 h a 4 °C. Los filos que aparecieron y desaparecieron con el tiempo tenían frecuencias relativas muy bajas (de 0,001% a 0,14%) y era sólo en unas pocas muestras (de 1 a 5 muestras).

Dado que en los eyaculados de macho cabrío el protocolo para la preparación de dosis refrigeradas modifica mucho la microbiota original, es probable que estos cambios contribuyan a disminuir la capacidad fecundante de las dosis refrigeradas. No es una cuestión de que aparezcan bacterias que sean patógenas y provoquen enfermedad, sino que quizás esas alteraciones en la composición microbiana provoquen interacciones desconocidas entre bacterias. Es posible incluso que a la temperatura de conservación utilizada (refrigeración, 4 °C) se inhiba el crecimiento de ciertas bacterias mientras que otras puedan crecer. Por otra parte, no se puede olvidar el efecto que tienen los antibióticos presentes en muchos diluyentes seminales sobre algunas bacterias. Así, estudios recientes sobre la microbiota intestinal han puesto de manifiesto que los metabolitos producidos por algunas bacterias tienen un efecto inhibidor sobre la microbiota existente (Brownlie et al., 2022). Estas bacterias pueden afectar el ecosistema microbiano al inhibir el crecimiento de algunas especies, pero no de otras.

Cada vez son más los estudios que demuestran que el microbioma seminal puede influir sobre la fertilidad de las hembras mediante la interacción que se establece con el microbioma uterino. Estas comunidades microbianas podrían influir sobre la implantación embrionaria al mejorar el ambiente uterino y así incrementar la tasa de preñez, así como podrían mediar en la respuesta inmune femenina y en la producción de citoquinas para favorecer la implantación (Luecke et al., 2022).

Sin embargo, aún está por determinar si las bacterias que se agregan durante la preparación y almacenamiento de las dosis refrigeradas, son viables y biológicamente activas o no y todavía está por esclarecer cómo afectan estos cambios inducidos en la microbiota seminal a la fertilidad final.

En resumen, estas técnicas de secuenciación masiva abren la puerta para realizar numerosos estudios y tratar de determinar cómo afectan diferentes procesos a la microbiota original de los eyaculados. No obstante, todavía quedan por esclarecer numerosos puntos ya que desconocemos si esas modificaciones observadas tienen algún efecto biológico sobre la fertilidad final o si hay algún género bacteriano que afecte positiva o negativamente sobre las tasas de fertilidad. No obstante, se abren nuevas vías para la búsqueda de biomarcadores de fertilidad en ganadería.

Agradecimientos

Los autores agradecen a J. Bernácer por su ayuda durante la extracción del semen y a Amurval y Acrimur por proporcionar los machos usados en el estudio. Este trabajo fue financiado por GVA-IVIA y cofinanciado por la UE a través del Programa Operativo Feder de la Comunitat Valenciana 2021-2027 (IVIA 52201-K), Amurval (número de contrato 71714), Universidad Cardenal Herrera-CEU, Universidades CEU (proyecto INDI22/38) y las expresiones de interés Agroalnext/2022/063 y Agroalnext /2022/062.

Bibliografía

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