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De Abbe a la superresolución

Microscopio con resolución de 20 nm

Pascual Bolufer, miembro de la Asociación Española de Comunicación Científica30/06/2016

Eric Betzig, S.W.Hell y William E. Moerner, Premios Nobel 2014 crearon el microscopio óptico de superresolución de 20 nanómetros, para observar el nanomundo de las moléculas y células vivas. En el comercio ha sido un éxito.En Barcelona el Instituto de Ciencias Fotónicas estudia la nanofotónica y la superresolución.

Durante muchos años se pensó que la microscopia óptica tenía un límite infranqueable, el límite de difracción de Abbe, que impedía obtener más resolución y ver separados dos puntos próximos. Con las moléculas fluorescentes se ha superado el límite de Abbe.
Ahora ya es posible analizar mediante microscopia biomoléculas y estructuras a escala nanométrica. Ya podemos visualizar moléculas individuales dentro de células vivas, es decir, células que se mueven. Observar, por ejemplo, cómo las moléculas crean sinapsis entre las células nerviosas del cerebro o rastrear cómo se agregan las proteínas implicadas en el parkinson y el alzheimer. También es posible seguir a moléculas individuales en huevos fertilizados, mientras evolucionan hacia embriones.
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Célula del sistema inmunológico vista con tres niveles de resolución, de izquierda a derecha aumentando.
En 1873, el microscopista alemán Ernst Abbe impuso un límite fijo de resolución máxima de la microscopia tradicional, que nunca podría ser mayor que 0,2 micras, 2 milésimas de milímetro. Abbe se refiere a un hecho que nadie discute: la difracción de la luz. Si hacemos pasar un rayo de luz a través de un orificio, una abertura circular estrecha en una placa, la luz se desvía y forma a distancia un cono sobre una pantalla. En ella observamos una sucesión de anillos de luz concéntricos, con un punto central de máxima luz. Los discos concéntricos de Airy son una distribución de irradiancias y en el centro, el punto o anillo central, que concentra el 83,9% de la luz del cono inicial.
Si enviamos dos puntos de luz sobre la pantalla muy juntos, por difracción ya no vemos a simple vista 2 puntos sino uno solo. Llamamos resolución del sistema la capacidad de ver en la pantalla los dos puntos por separado, cada uno rodeado de los anillos de Airy. La fórmula de Abbe es sencilla: la resolución es de 1,22 multiplicado por la relación longitud de onda (el color) dividida por el diámetro en metros del orificio circular que hicimos en la placa para que pasara la luz.
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Célula del sistema inmunológico observada con microscopio de superresolución.

Si la longitud de onda es grande (luz roja) la resolución será pequeña y no veremos en la pantalla los dos puntos de luz por separado, sino mezclados. Para resolver el problema de separar los dos puntos utilizamos la apertura numérica del orificio que hemos creado en la pantalla o de la lente colocada en el orificio. La apertura numérica es el ángulo de aceptancia de la luz; una lente casi plana tiene un ángulo de aceptancia muy pequeño. Una lente convexa con un ángulo grande y radio pequeño nos dará una buena resolución y veremos los dos puntos por separado.

Si en lugar del orificio en la placa o la lente convexa usamos una fibra para transportar el rayo de luz, esa fibra también tiene su apertura numérica.

Resolución nanométrica

Las moléculas fluorescentes superan esa barrera de Abbe. Ahora ya disponemos de la microscopia de una sola molécula: la posibilidad de encender y apagar la fluorescencia de moléculas individuales, rastreando una misma zona varias veces para permitir que solo algunas moléculas intercaladas brillen cada vez. E. Betzig, en 2006, logró por primera vez la superposición de estas imágenes y consiguió una superimagen densa con una resolución nanométrica, 20 nm. Así logramos nuevos conocimientos, que aportan grandes beneficios a la Humanidad.
Ya disponemos de varios tipos de microscopios de superresolución, fabricados por Nikon, Zeiss y Leica y los investigadores los usan para describir fenómenos biológicos y estructuras que antes desconocían. Nuestro cerebro usa dos lentes, los ojos, para ver la tercera dimensión del objeto y la distancia a que se encuentra, pero esa resolución no es suficiente en biología y menos en este tiempo en que ya no tenemos la barrera del límite de difracción de Abbe, en donde dos puntos se ven como uno.
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Tejido nervioso observado con alta resolución.
En 2006 X. Zhuang, en la Universidad de Harvard, logró localizar una sola molécula con una resolución de 20 nm y en tres dimensiones en los 3 planos x, y y z del objeto. Zhuang insertó una lente cilíndrica en el microscopio óptico de gran apertura numérica. La luz procedente de una sola molécula produjo no un círculo luminoso, sino una elipse que nos indica la posición axial de la molécula y con una resolución de 50 nm. Luego colocó una lente objetivo debajo y encima de la muestra, y en combinación de la lente cilíndrica, logró una resolución de 20 nm.
El sistema lo usaron para observar una neurona de rata en el laboratorio y descubrieron algo nuevo: debajo de la membrana de plasma del eje axonal observaron un citoesqueleto, formado por anillos periódicos de actina verde, de una dimensión de 180 nm, separados por espaciadores magenta de espectrina, formando un endamiaje eficaz. La célula posiciona con precisión las proteínas de la membrana (los canales de iones) y asegura la propagación de los impulsos nerviosos. Nunca se habían visto los anillos de nectina en los axones, pese a los 20 años de microscopia electrónica.
El profesor S.W. Hell, del MaxPlanck Institute, nos recuerda que un rayo de luz que se propaga libremente se difracta. Los microscopios de Leica son sistemas de localización con mayor resolución que otras marcas, pero obtener la imagen requiere más tiempo, porque hay que combinar miles de imágenes para formar la definitiva. El investigador J. Lippincot de National Institutes of Health reconoce que las primeras imágenes requerían horas, pero ahora se logran en solo 5 minutos, si aspiramos a una resolución de solo 100 nm.
Se tarda mucho tiempo en formar la imagen, por eso la localización en microscopia de superresolución es poco apta para el estudio de células vivas. Una solución podría consistir en substituir las CCD con las cámaras sCMOS, que pueden capturar miles de fotos por segundo. En 2013, Bewerdorf usó una cámara sCMOS que registraba imágenes de superresolución, 32 por segundo. Leica tiene una cámara con sCMOS que reduce el tiempo a un minuto. Los experimentadores tienen la palabra, hasta qué punto se puede usar para observar células vivas.
Los investigadores han ideado soluciones alternativas con sCMOS. En Barcelona, en el Instituto de Ciencias Fotónicas, Melike Lakadamyali estudia microtúbulos de vesícula y cómo las proteínas motor transportan esas vesículas en una célula viva en movimiento. Esas vesículas se desplazan y la trayectoria se observa con una cámara PALM (Photoactivated localization microscopy). Las vesículas se detienen en las intersecciones de microtúbulos, en la separación de dos microtúbulos, pero a veces navegan a través de la intersección. Melike utiliza un sistema de seguimiento de partículas 3D en la búsqueda de microfilamentos asociados a los microtúbulos de la célula viva. Esa es la microscopia de localización de células vivas, con resolución de pocos nanómetros, que reduce en un 10% el número de imágenes necesarias. Podemos observar los miocitos cardíacos.

El miocito

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Superficie monatómica de grafeno vista con alta resolución.
El miocito es una fibra que encontramos en los músculos de los animales. Es una célula muy especializada que se diferencia fácilmente de otros tipos celulares, debido a sus características morfológicas y sobre todo por sus características citológicas. En el músculo, el miocito es el elemento contráctil básico, tanto en la musculatura lisa como en la estriada esquelética y estriada cardíaca. Todos los miocitos comparten un elemento común: las proteínas que forman su citoesqueleto y le dan una capacidad contráctil única. Los miocitos del músculo esquelético son el resultado de la fusión de varios mioblastos, células musculares indiferenciadas con gran capacidad replicativa. Los miocitos del músculo liso también derivan de los mioblastos, solo que no por fusión de varios de ellos. Los miocitos del músculo liso presentan una morfología fusiforme, mientras que los estriados esqueléticos son cilíndricos, y los miocitos cardíacos tienen forma de Y. Los miocitos del músculo esquelético tienen una característica citológica, son plurinucleados.

La superresolución es un gran paso hacia adelante

E. Betzig ha logrado en poco tiempo resoluciones de 45 nm, suficiente para muchos trabajos en biología y medicina. Pero en 2014 a los que concedían el Premio Nobel la cantidad de tiempo no tenía interés. El MIT americano en la investigación de la sinapsis neurológica usa un plástico hinchable para mejorar la resolución, que aumenta su volumen en 5 veces. Eso equivale a pasar de una resolución de 200 nm a otra de solo 40 nm. En microscopia el futuro nunca se había visto tan brillante y con tanta precisión.

Referencias:

J.Perkel, Superresolution microscopy. Science p850-860- 2016

J.Mervis, NSF Director unveils Big ideas. SWcience p.755-759 2016

E.Sargent, States of Mind. Book Frazetto 2016

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