Toxicidad en aguas residuales de centrales citrícolas debidas a tratamientos po
A. INTRODUCCIÓN
En los almacenes frutícolas, las frutas destinadas a consumo en fresco son sometidas a una serie de operaciones destinadas a garantizar la calidad del producto, cuyo objetivo será:
- Eliminar la suciedad y los residuos adheridos al tejido.
- Proteger frente a la colonización de microorganismos alterantes (fundamentalmente hongos) y a las pérdidas de agua del tejido.
La forma de aplicar los tratamientos de desinfección en las líneas de confección incluye el uso de baños, duchas y la combinación de ambos. En estos baños y duchas la concentración de sustancias activas (fungicidas, desinfectantes...) suele ser muy elevada, dependiendo de¡ grado de contaminación (micro y macrobiológica) con que la fruta llegue al almacén y de la incidencia de podredumbres en ese momento de la campaña. La efectividad de estos tratamientos presenta problemas cuando, con el fin de ahorrar productos, el agua se recicla, añadiendo fungicidas y desinfectantes. Así mismo, el agua de lavado arrastra la suciedad que cae desde las cajas superiores hasta las cajas situadas en el fondo de¡ palet (gran cantidad de cajas se someten simultáneamente a la ducha), práctica que supone una acumulación de sustancias contaminantes.
Resumiendo, los tratamientos tradicionales empleados en la manipulación general de frutas están basados, como hemos comentado anteriormente, en el uso de desinfectantes, detergentes, fungicidas y/o recubrimientos céreos al agua, sustancias todas ellas que contribuyen de forma individual y/o combinada a la elevada ecotoxicidad de las aguas residuales de proceso procedentes de almacenes citricolas.
DIAGRAMA DE FLUJO DE MATERIAS PRIMAS Y DE LOS CONTAMINANTES
Diagrama de operaciones generales de una Central Citrícola.
Los cuadros sombrados indican los puntos críticos en la contaminación de las aguas residuales del procesoB.OBJETIVOS
- Determinar la toxicidad de las sustancias activas empleadas en tratamientos postcosecha en almacenes citrícolas.
- Estudiar la sensibilidad de los sistemas analíticos empleados para determinar la toxicidad.
- Evaluar la efectividad de tratamientos en relación con la toxicidad que aportan mediante ensayos con fruta en planta piloto.
BIOENSAYOS para la determinación de la Toxicidad
El valor de la medida de toxicidad como sistema evaluador de los efectos que un efluente ocasiona sobre el medio ambiente está reconocido de forma prácticamente unánime. En este contexto, la importancia de los llamados "biotests", procedimientos en los que se emplean organismos vivos para determinar la toxicidad de una muestra, es cada vez mayor, siendo el test de peces uno de los más clásicos. La homologación de otros biotests tales como los de algas, rotíferos, cladóceros y fotobacterias ha ampliado el espectro de organismos a emplear en la valoración de la calidad de una muestra.
El bioensayo de inhibición de la movilidad de Daphnia magna y el bioensayo de inhibición de la luminiscencia en Photobacteríum phosphoreum, ambos homologados por la normativa vigente en España para la determinación de la ecotoxicidad en muestras ambientales (Ley de residuos tóxicos y peligrosos de¡ 13 de Octubre de 1989), suponen alternativas mucho más rápidas a los clásicos estudios de toxicidad para peces de larga duración. Por ello, y teniendo en cuenta su fiabilidad, reproducibilidad y rapidez en obtención de resultados, estos bioensayos han sido los dos sistemas analíticos seleccionados para determinar la toxicidad en el estudio.
El bioensayo de inhibición de la movilidad de Daphnia magna utiliza como organismos test, un constituyente del zooplancton de aguas dulces, el cladócero D. magna, sensible a un amplio espectro de sustancias tóxicas presentes en aguas residuales (hidrocarburos, pesticidas, herbicidas ... ). Este bioensayo se lleva a cabo de acuerdo con el procedimiento estándar descrito en el punto C.2. "Toxicidad aguda en Daphnía" de la Directiva de la Comisión de las Comunidades Europeas 841449/CEE (CEE, 1984). Este procedimiento queda así mismo recogido en el estándar internacional ISO 6341-1989, así como en el estándar DIN no. 38412 y la norma AFNOR T-90-301. En este ensayo, la toxicidad aguda viene expresada por la concentración media efectiva (CE-50) de una sustancia que provoca la inmovilización de Dafnía en agua dulce (en una serie de ensayos) durante un período de exposición continua (24 h) a dicha sustancia. La exigencia de la Directiva se cumple mediante la determinación de la CE-50. Básicamente, el ensayo se realiza situando a un número de individuos juveniles en un recipiente de vidrio conteniendo 25 ml de una solución de la sustancia (s) a analizar. Este método utiliza un sistema estático y el resultado final se determina a las 24 h de contacto, considerando inmovilizados los individuos cuando son incapaces de desplazarse durante los 15 segundos siguientes a una ligera agitación del recipiente de ensayo. Los valores de la EC-50-24 se calculan utilizando un programa de ordenador IBM según el procedimiento descrito por Litchfíeld y Wilcoson (1949). En paralelo, se somete a ensayo una sustancia de referencia para demostrar que la sensibilidad M organismo no se ha modificado, y se mantienen los respectivos controles de supervivencia (testigos).
El bioensayo de inhibición de la luminiscencia en Photobacterium phosphoreum, más sencillo que el anterior, utiliza como organismos test bacterias marinas bioluminiscentes (P. phosphoreum) y posee una aplicabilidad universal, al permitir medir la toxicidad de residuos que contengan metales pesados, hidrocarburos, ciorados, pesticidas.... En los últimos años, sistemas completos para llevar a cabo este test, denominados Lumistox y Microtox, han sido desarrollados y comercializados. El test es un ensayo de inhibición metabólica que utiliza como organismo indicador una suspensión estandarizada de una cepa de la especie bacteriana luminiscente P. phosphoreum, sensible a un amplio espectro de compuestos tóxicos. El bioensayo se basa en una relación concentración-efecto, teniendo como objetivo determinar la concentración de la muestra que causa una reducción del 50 % en la emisión de luz por parte del microorganismo (EC50). Este sistema de ensayo está totalmente estandarizado (estándar DIN no. 38412 y norma AFNOR T-90-320), ya que las bacterias se obtienen liofilizadas (este tipo de conservación garantiza el mantenimiento, estabilidad y sensibilidad del organismo) y están disponibles para uso inmediato tras su reconstitución con agua. Se trata de un ensayo de reproducibilidad alta, cuyo procedimiento es fácil, simple y relativamente rápido. Un programa de tratamiento de datos, tras almacenar y analizar los mismos, genera informes detallados con el resultado M ensayo expresado en %, mg/litro y Unidades de Toxicidad (U.T.).
Hasta la actualidad, apenas existía información relativa a la toxicidad de sustancias de uso común en Centrales Hortofrutícolas tales como fungicidas, desinfectantes y ceras empleadas en los diversos tratamientos M producto. Por ello, consideramos que seria de gran interés el poder establecer un modelo toxicológico para predecir la toxicidad de estas sustancias, de forma similar a lo realizado por otros autores en otros sectores industriales, en los cuales las predicciones (basadas en la toxicidad individual y en la concentración de cada compuesto) mostraron buenas correlaciones con la toxicidad de los residuos determinada mediante los bioensayos de bioluminiscencia y Daphnia. Dicho de otra forma, que sería interesante poder correlaccionar el grado de ecotoxicidad de una muestra de agua residual del sector que nos ocupa (efecto) y las sustancias presentes en dicha muestra (causa).
A semejanza de lo que se ha realizado en el presente proyecto, algunos estudios de evaluación de toxicidad han utilizado, entre otros, los dos bioensayos citados, con la finalidad de establecer una comparación entre métodos y evaluar su idoneidad a la hora de determinar la toxicidad de determinados residuos. Los resultados de dichos estudios pusieron de manifiesto la necesidad de emplear más de un bioensayo para la determinación del impacto de una sustancia contaminante de una forma más realista desde el punto de vista ecológico. No hay que olvidar que cada sistema analítico tiene su propia capacidad de detección en función del tipo de contaminante.
Teniendo en cuenta lo anteriormente comentado, la finalidad del uso simultáneo de los dos bioensayos citados en el presente proyecto ha sido:
- Comparar la sensibilidad del microbiotest frente al clásico test de D. magna.
- Establecer cuál de ellos sería más justo a la hora de evaluar la toxicidad de las aguas residuales del Sector Hortofrutícola.
C. RESULTADOS
Toxicidad de sustancias a nivel individual
Se ha determinado la toxicidad mediante los dos sistemas analíticos citados en el apartado anterior (bioensayo con P. phosphoreum, mediante sistema Microtox, y bioensayo con D. magna) de diferentes sustancias activas empleadas en los tratamientos postcosecha aplicados en los almacenes citrícolas:
- Fungicidas (TBZ, Procloraz, Imazalil y OPP)
- Desinfectantes (hipoclorito sódico)
- Detergentes
- Ceras (A, polietileno+goma laca; B, poi ietileno+carnauba+goma laca)
Para ello, se prepararon soluciones de estas sustancias a diferentes concentraciones: desde la concentración que corresponde a los LMRs (límite máximo residual) de fungicida en fruta hasta las concentraciones de uso normal o las recomendadas por los fabricantes de productos de limpieza y desinfección disponibles en el mercado.
Los resultados obtenidos han demostrado que la mayoría de las sustancias estudiadas presentan un apreciable carácter tóxico (medido como unidades de toxicidad, U. T. ) a las concentraciones de uso normal (Figuras 1 y 2).
Con respecto a los niveles de toxicidad detectados, hay que destacar:
1) El elevado carácter tóxico (2:300 Unidades de Toxicidad) de la mayoría de los fungicidas estudiados a las concentraciones de uso normal (>=2000 ppm). Sólo en el caso del fungicida TBZ, los valores de toxicidad detectados han sido signifícativamente más bajos (<200 Unidades de toxicidad), especialmente cuando el sistema analítico empleado fue Microtox.
2) El elevado carácter tóxico del detergente y las ceras a las concentraciones de uso normal (2450 ppm y 10-18% respectivamente), mediante el sistema analítico Microtox.
3) El moderado carácter tóxico del hipoclorito sódico a la concentración de uso normal (160 ppm), independientemente del sistema analítico empleado.
Prácticamente en todos los casos, e independientemente del bioensayo utilizado, el grado de toxicidad de las muestras se ha correlacionado de forma positiva con la concentración de la sustancia activa presente en las mismas, siguiendo en muchas ocasiones un modelo aproximadamente lineal.
Finalmente, comentar que, aunque las concentraciones finales de estas sustancias en los efluentes que van a ser vertidos a cauce público sean siempre mucho más bajas que las utilizadas en el baño o drencher, es muy importante tratar de minimizar éstas, especialmente en el caso de los fungicidas, teniendo en cuenta los problemas medioambientales que su presencia en las aguas residuales trae consigo (interacción con otras sustancias con posterior formación se productos no deseables, alta persistencia...
Toxicidad de sustancias combinadas
Se ha estudiado la toxicidad de las sustancias activas evaluadas en la fase anterior combinadas entre sí (referenciadas como "mezclas").
Para la formulación de las mezclas de sustancias a estudiar se han considerado las combinaciones empleadas en los almacenes de cítricos dedicados tanto a producción tradicional como a producción integrada.
En este sentido, se ha tenido en cuenta que, por un lado, las asociaciones entre Tiabendazol, Imazalil y Procioraz y la de éstos con otros fungicidas son muy frecuentes, ya que su espectro de acción es más amplio que el de sus componentes por separado y reducen la posibilidad de aparición de razas resistentes y, por otro lado, las formulaciones de fungicidas que contienen ceras mejoran el efecto del fungicida al conseguir una mejor conservación de los frutos, de ahí su aplicación frecuente.
Los resultados obtenidos han demostrado la existencia de diferentes efectos o tendencias, dependientes de la naturaleza de la muestra:
1. Efecto, de tipo aditivo, detectado cuando el valor de la toxicidad de la mezcla es el resultado de la suma de los correspondientes valores de los componentes individuales. Esta tendencia se observa en la mayoría de las muestras estudiadas: mezclas compuestas por diferentes fungicidas a concentraciones similares, por fungicida y detergente, por detergente y desinfectante o por fungicida y cera A (estos dos tipos últimos de muestras sólo en el caso del sistema analítico Microtox).
2. Efecto de tipo sinérgico, detectado cuando el valor de la toxicidad de la mezcla está potenciado con respecto al valor resultante de la suma de la toxicidad de sus componentes. En estos casos, el valor de la toxicidad de la mezcla resulta ser 2-3 veces mayor que la suma de los valores de los componentes individuales. Esta tendencia se observa en las mezclas compuestas por fungicida y cera B cuando se utiliza el sistema analítico Microtox y sólo en algún caso puntual cuando se utiliza el bioensayo con Dafnia.
3. Efecto de dominancia, detectado cuando algún componente de la mezcla altamente tóxico es el responsable de la toxicidad de la misma. Es el caso de mezclas de fungicidas con diferente grado de toxicidad a nivel individual (ya sea por su propia naturaleza o por su concentración en la muestra) en las cuales el valor de toxicidad viene determinado por el componente más tóxico. Este efecto también se ha observado en mezclas que contienen fungicidas y cera cuando son analizadas mediante el sistema Microtox, en las cuales la toxicidad es aportada por el componente céreo. Así mismo, en mezclas que contienen detergente cuando se utiliza el bioensayo con D. magna, la toxicidad está asociada a la presencia de otros componentes (fungicida o desinfectante).
Los resultados obtenidos han puesto de manifiesto que la combinación de tratamientos químicos tradicionales (cócteles de amplio espectro de actuación) empleados en los almacenes citrícolas, con el fin de aumentar la efectividad de los mismos, podría traer consigo un importante aumento de la toxicidad final de las aguas liberadas después de los tratamientos aplicados a la fruta. En este sentido, y teniendo en cuenta las tendencias generales observadas, se podría predecir de forma aproximada cómo la interacción de las diferentes sustancias activas de una mezcla utilizada en los sistemas de tratamiento postcosecha de fruta repercutiría en los valores de toxicidad de los efluentes del almacén.
Sensibilidad de los bioensayos empleados
Los resultados obtenidos a lo largo del desarrollo del proyecto han puesto de manifiesto que la interpretación de los valores de ecotoxicidad de los efluentes no es sencilla, fundamentalmente porque el comportamiento individual de las diferentes sustancias activas estudiadas varía significativamente en muchas ocasiones en función del sistema analítico empleado.
Este hecho ha quedado claramente demostrado en el caso de las ceras y detergentes que se utilizan en tratamientos de higienización de frutas. Estas disparidades, lógicamente, pueden dar lugar a especulaciones sobre qué método es el más idóneo como indicador fiable de la toxicidad de aguas que contengan este tipo de residuos.
El estudio realizado nos ha permitido, por tanto, conocer la respuesta de los dos bioensayos ante diferentes sustancias activas empleadas en tratamientos postcosecha de fruta y, tal como se preveía, los resultados han sido variables, dependiendo las diferencias encontradas fundamentalmente de la naturaleza de los componentes de la muestra. Así, mientras la toxicidad del desinfectante y los fungicidas OPP y Procioraz ha resultado ser muy similar, no ha ocurrido lo mismo con las otras sustancias estudiadas:
1) En el caso de las ceras y detergente, la toxicidad ha sido muy elevada utilizando el bioensayo de inhibición de luminiscencia y moderada-baja empleando el de inhibición de movilidad de D. magna.
2) En el caso del fungicida TBZ, los valores obtenidos mediante el sistema Microtox han resultado significativamente más bajos que los obtenidos empleando el bioensayo con D. magna (Figura l).
3) La toxicidad del fungicida Imazalil a concentraciones mayores de 1000 ppm ha resultado significativamente más elevada mediante el sistema Microtox.
Los valores de ecotoxicidad de las mezclas de sustancias activas también han sido diferentes dependiendo del bioensayo utilizado, especialmente en el caso de aquellas combinaciones en las que estaba presente una cera, en las cuales los valores obtenidos utilizando el bioensayo de inhibición de luminiscencia han resultado significativamente más elevados que los obtenidos empleando. el bioensayo con D. magna
Ensayos con fruta
Selección de tratamientos. Para la realización de los experimentos con fruta a escala piloto, se han seleccionado sistemas de tratamiento combinados menos contaminantes que "a priori" resultaran efectivos en la reducción de la carga microbiana y que pudieran ser incorporados/aplicados de forma coherente a una línea de confección de producto.
Todos los tratamientos han incluido la aplicación de fungicidas, de ahí que las condiciones de proceso se hayan fijado teniendo en cuenta que el nivel de residuos en producto había de mantenerse por debajo de los límites marcados por la legislación vigente.
Los fungicidas que se han utilizado en los experimentos de esta fase final de¡ proyecto son aquellos incluidos en la normativa referente a producción Integrada de Cítricos según las Normas de Producción Integrada para Cítricos de la Comunidad Valenciana (Resolución de 31 de julio de 1997, DOGV No. 3066), de la Generalitat Catalana y de la Comunidad de Murcia. (Orden de 24 de junio de 1998, del Diario Oficial de la Región de Murcia), así como en la Unión Europea en zonas productoras como Italia.
Estos fungicidas son para el caso de los cítricos: Imazalil, Tiabendazol y el Ortofenilferiol.
La composición de los diferentes tratamientos utilizados (nombrados com A1, A2, B1, B2, D1, D2) en las experiencias con frutas llevadas a cabo en planta piloto se indica en la tabla 1.
Tabla 1. Características de los tratamientos seleccionados.
A1 B1 D1 Tiabendazol
5000*
Imazalil
2000*Tiabendazol
2500*
Imazalil
1250*
Ta de aplicación 37oCOrtofenilfenol
2000*
Tiabendazol
3000*A2 B2 D2 Tiabendazol
2500*
Imazalil
1250*Tiabendazol
2500*
Imazalil
1250*
Ta de aplicación 47oCOrtofenilfenol
1000*
Tiabendazol
1500**ppm Preparación de la matriz vegetal y aplicación de los tratamientos seleccionados. Los ensayos llevados a cabo en planta piloto con los sistemas de tratamiento seleccionados se han realizado con naranjas de la variedad Navelina, utilizando aproximadamente 40 Kg de producto en cada uno de los tratamientos.
Las naranjas provenientes del campo se han lavado con agua potable para eliminar restos de tierra etc. A continuación, se han secado parcialmente y se les han aplicado los diferentes tratamientos señalados anteriormente, mediante inmersión en baño durante un minuto, seguido de escurrido y secado, para pasar a la fase final de encerado mediante la aplicación de la cera B.
Inoculación de producto. Inmediatamente después de la aplicación de los diferentes tratamientos y correspondiente secado, la mitad de los productos tratados se han infectado con una cepa del moho Penicillium digitatum (aproximadamente 105 esporas/fruto inoculadas en herida provocada externamente), uno de los principales causantes de problemas de podredumbres en cítricos durante los períodos de almacenamiento postcosecha.
Toxicidad de los baños. Tal como queda reflejado en la figura 3, los valores más elevados de toxicidad (> 1500 o >700 U.T., dependiendo del sistema analítico empleado) se han correspondido con los valores de pH más bajos (<4).
Figura 3 Valores de ecotoxicidad y pH en los diferentes baños de tratamiento.
T0=Antes del tratamiento de los frutos
Tf=Después del tratamiento de los frutos.Tal como se esperaba, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en las mezclas de sustancias activas elaboradas en el laboratorio, en los valores de toxicidad de los baños se han observado efectos de tipo aditivo o de dominancia:
1) El efecto aditivo se ha detectado en los baños de los tratamientos A y B, en los cuales estaban presentes los fungicidas TBZ e Imazalil mediante sistema Microtox y bioensayo con D. magna, respectivamente.
2) En los tratamientos DII y D2, el efecto observado ha sido de dominancia de la toxicidad del fungicida OPP cuando la muestra se analizaba mediante sistema Microtox. No hay que olvidar la dificultad del fungicida TBZ para homogenizarse en los baños, de forma que su concentración real en los mismos es siempre bastante inferior a la deseada
Cabe destacar que, de todos los tratamientos estudiados, el A1 es el que presenta mayores valores de toxicidad, independientemente M sistema analítico empleado para su determinación.
Estudio de vida útil de los productos sometidos a los tratamientos seleccionados. Las naranjas, una vez sometidas a los sistemas de tratamiento correspondientes, se han almacenado a temperatura de refrigeración (7-8oC) durante un período de 2 meses. Durante el almacenamiento de los productos se ha controlado el nivel de residuos de fungicidas y la incidencia de podredumbres.
En general, y tal como se refleja en la figura 4, la cantidad de fungicidas que permanece en los frutos durante la primera semana de almacenamiento no ha superado los límites establecidos por la legislación vigente (LMRs).
Figura 4. Niveles residuales de fungicidas en fruta.
Es importante destacar que el inclemento de la Ta del baño ha traído consigo el ligero aumento de residuos de fungicida en los frutos, especialmente cuando la Ta era de 47oC. Es el caso de aquellos frutos que recibieron el tratamiento B2, en los que la concentración residual del fungicida Imazalil (valores de 5,3 ppm) ha superado ligeramente el LMR correspondiente (5 ppm).
La efectividad de los tratamientos aplicados a los frutos inoculados o no con P. digítatum se ha evaluado en función del éxito de los mismos a la hora de ralentizar la aparición de podredumbre (Tablas 2 y 3).
Tabla 2. Porcentaje acumulado de frutos dañados (aparición de podredumbre) en producto no inoculado con P. digitatum durante el almacenamiento a 8oC.
Tiempo de almacenamiento (días)
Tratamiento 10 22 30 45 65 Control 1.2 2.6 3.8 7.8 10.4 A1 0 3.2 4.8 4.8 8 A2 0 4.3 4.3 5.8 7.2 B1 0 0 0 1.5 2.9 B2 0 3.7 3.7 5 5 D1 0 0.65 2.6 4 6.5 D2 0 1.9 1.9 1.9 4.6 A1, TBZ (5000 ppm) + Imazalil (2000 ppm); A2, TBZ (2500 ppm) + Imazalil (1250 ppm)
B1, TBZ TBZ (2500 ppm) + Imazalil (1250 ppm), Ta del baño=37oC;
B2, TBZ (2500 ppm) + Imazalil (1250 ppm), Ta del baño=47oC;
D1, OPP (2000 ppm) + TBZ (3000 ppm); D2, OPP (1000 ppm) + TBZ (1500 ppm).Tabla 3. Porcentaje acumulado de frutos dañados (aparición de podredumbre) en producto inoculado con P. digitatum durante el almacenamiento a 8oC.
Tiempo de almacenamiento (días)
Tratamiento 10 22 30 45 65 Control 90 98.7 100 A1 0 3.4 3.4 18.6 81.3 A2 1.2 3.7 4.9 17 79.3 B1 3.8 5.1 6.3 40 69.6 B2 4.4 6.6 10 33.3 73.3 D1 10.4 17.4 18.6 43.1 79.8 D2 10.4 14.0 14.0 42.2 73.8 A1, TBZ (5000 ppm) + Imazalil (2000 ppm); A2, TBZ (2500 ppm) + Imazalil (1250 ppm)
B1, TBZ TBZ (2500 ppm) + Imazalil (1250 ppm), Ta del baño=37oC;
B2, TBZ (2500 ppm) + Imazalil (1250 ppm), Ta del baño=47oC;
D1, OPP (2000 ppm) + TBZ (3000 ppm); D2, OPP (1000 ppm) + TBZ (1500 ppm).
Dña. Belén Fouz, Dña. Marina Serra / AINIA
