Marcas, identidad, comunicación, formación: Gestión integral de la comunicación y el conocimiento
En el presente trabajo se ha estudiado el efecto de la aplicación in vitro de CaCl2 a varios aislados de B. cinerea creciendo durante 36 días a 26 °C sobre agar de patata y dextrosa (PDA)

Las aplicaciones de cloruro de calcio afectan al desarrollo de diversos aislados de 'Botrytis Cinerea' obtenidos de plantas ornamentales

Martínez, J.A.; Dpto. Producción Vegetal (UPCT)

Gómez-Bellot, M.J.; Centro de Edafología Aplicada del Segura (CSIC-CEBAS)

Bañón, S.; Dpto. Producción Vegetal (UPCT) y Horticultura Sostenible en Zonas Áridas (Unidad Asociada al CSIC-CEBAS)

23/01/2012
El hongo 'Botrytis cinerea' invade los tejidos debilitados de las plantas causando ‘Botrytis blight’ en la mayoría de ornamentales. Es muy frecuente en poscosecha infectando a frutas, hortalizas y flores, donde provoca la denominada podredumbre gris. La investigación sobre la manipulación y transporte se agrava por las infecciones latentes que pasan desapercibidas en el momento de la cosecha, pero que se desarrollan posteriormente. La utilización de aplicaciones de sales de calcio son útiles para favorecer la resistencia natural de las frutas y hortalizas a los patógenos debido a que provoca un aumento del contenido en calcio de los tejidos de las plantas y los efectos protectores contra 'B. cinerea'. Adicionalmente, las aplicaciones de CaCl2 a los hongos reducen la longitud del tubo germinativo de los conidios, la germinación de los conidios y pueden influenciar el crecimiento micelial, dependiendo del aislado.
En el presente trabajo se ha estudiado el efecto de la aplicación in vitro de CaCl2 a varios aislados de 'B. cinerea' creciendo durante 36 días a 26 °C sobre agar de patata y dextrosa (PDA), que fueron obtenidos de plantas ornamentales en maceta ('Pelargonium x hortorum', 'Lantana camara,' 'Lonicera japonica', 'Hydrangea macrophylla' y 'Cyclamen persicum') afectadas de 'Botrytis blight' en el sureste de España . Los aislados presentaron diferencias fenotípicas entre ellos, tal y como reportaron los autores en Martínez et al. (2008). En estas condiciones, las curvas de crecimiento micelial y las tasas de crecimiento se cuantificaron teniendo en cuenta la evolución de las áreas de las colonias durante la fase lineal de crecimiento.

También se midió la conidiogénesis (medida como el número de conidios producido por unidad de área micelial y el tiempo de aparición), la masa de micelio aéreo y sumergido dentro del medio de cultivo y la producción de esclerocios formados (recuento por placa). El CaCl2 aumentó el crecimiento micelial del aislado de 'H. macrophylla', desde 15 cm2/día (0 g/l) hasta 18 cm2/día (16 g/l) y lo retrasó en los aislados de 'L. camara' y 'L. japonica'. La dosis de 16 g/l de CaCl2 elevó el crecimiento del micelio aéreo de 'P. x hortorum' y la masa del micelio sumergido de 'H. macrophylla', pero no la de 'L. japonica'. La conidiogénesis se redujo con CaCl2, especialmente en el aislado de 'C. persicum' (cuatro veces más bajo que el control). Finalmente, el calcio redujo la producción de esclerocios en el aislado de 'H. macrophylla'. Esta variabilidad de respuesta entre aislados debería tenerse en consideración en las aplicaciones de calcio fundamentalmente para prevenir los ataques de hongos en poscosecha durante el transporte de plantas ornamentales en maceta.

Introducción

'Botrytis cinerea' Pers. ex Fr. se considera uno de los principales agentes de enfermedades en las plantas ornamentales, donde causa la denominada 'Botrytis blight' (Daughtrey et al., 1995). Este hongo presenta un hábito de vida saprofito en la naturaleza, pero en determinadas condiciones se convierte en patógeno oportunista muy agresivo. Causa una elevada cantidad de síntomas que incluyen clorosis y necrosis generalizadas, manchas en las hojas y flores, chancros y podredumbres de la corona en los tallos e incluso podredumbre de plántulas en algunos casos. Los productos frescos almacenados también son atacados por este hongo, especialmente los tejidos dañados o senescentes, pero también son susceptibles, en menor medida, los tejidos intactos. En poscosecha las enfermedades producidas por 'B. cinerea' son conocidas como podredumbre gris. Sin embargo, en poscosecha la investigación es escasa en relación al manipulado de plantas ornamentales en maceta donde inicialmente este hongo puede producir infecciones latentes asintomáticas que pueden proliferar durante transporte y almacenamiento.
'B. cinerea' pertenece al grupo Hyphomycetes en la clasificación de Saccardo (Barnett y Hunter, 1999). Sus hifas son de dos tipos: hialinas y ramificadas o rectas, de escasa ramificación y de color pardo, denominadas hifas acintadas. Posee conidióforos ramificados y septados, con extremos ensanchados y redondeados donde se disponen los conidios unicelulares, ovalados e hialinos, con un extremo más redondeado que el opuesto, donde se unen al conidióforo. La masa de conidios proporciona el típico color gris de este hongo. En el ciclo de vida de su fase típica anamorfa, que ocurre cuando se desarrolla como patógeno, se distingue una primera fase de estado vegetativo o somático en el que el micelio crece con hifas hialinas y acintadas, seguido de un estado reproductivo que ocurre cuando el micelio empieza a producir conidióforos que producen conidios o esporas típicas asexuales. Finalmente aparecen los esclerocios, cuerpos visibles negros más o menos esféricos o amorfos cuya función es contener materiales de reserva y actúan como estructuras de resistencia. Están formados por agregaciones firmes de hifas vegetativas caracterizadas por un determinado crecimiento y son capaces de persistir durante meses aún en condiciones adversas.
La especie 'B. cinerea' está muy estudiada. Se ha puesto de manifiesto que presenta una elevada variabilidad de caracteres, es decir, variabilidad fenotípica entre los distintos aislados, aunque los mecanismos envueltos en esta variabilidad no son del todo conocidos (Beever y Weeds, 2004). Se han caracterizado y clasificado diferentes tipos de aislados de acuerdo con sus caracteres morfológicos, que han sido citados en Martínez et al. (2003) y en Beever y Weeds (2004).

El calcio es un elemento mineral esencial en la constitución de las plantas. Está presente abundantemente en las paredes celulares donde tiene un papel fundamental en el fortalecimiento de su estructura. Este macronutriente forma parte también de las paredes celulares de la mayoría de los hongos y es esencial para la síntesis de la pared y el crecimiento hifal. En agricultura está presente habitualmente en todos los programas de abonado y se aplica generalmente complejado con ácidos orgánicos y aminoácidos para favorecer la asimilación y traslocación del calcio por toda la planta. Los aminoácidos, por sí mismos, actúan como activadores vegetativos consiguiendo que la posible carencia mineral se supere más rápidamente. El calcio utilizado en los bionutrientes procede generalmente del cloruro de calcio o cloruro cálcico (CaCl2). Es fácilmente asimilado por las plantas cuando se utiliza conjuntamente con ácido glucónico y aminoácidos. La utilización junto con aminoácidos previene y corrige las deficiencias cálcicas y se usan cuando es necesario potenciar algún proceso del desarrollo vegetal en cultivos que presentan síntomas carenciales, incluido los florales. Su formulación junto con boro es común, tanto para cubrir las necesidades normales del cultivo, como para prevenir o curar estados carenciales calcio-boro, tales como el acorchado ('bitter-pit') de la manzana, la necrosis marginal ('tip-burn') en fresa, la necrosis apical (peseta) del tomate, pimiento, aceituna o pepino, la caída prematura de las cápsulas de algodón, la podredumbre apical del apio, así como para superar situaciones de estrés o cuando se necesite reactivar los mecanismos de crecimiento y mejora de frutos. Ello es debido a que el boro actúa previniendo las fisiopatías atribuidas al calcio, pero en las que está reconocida una influencia del boro (De Liñán, 2009). Por otro lado, es un hecho reconocido que las aplicaciones de calcio en forma de CaCl2 son muy útiles para aumentar la resistencia natural de las frutas, hortalizas y flores a los patógenos, debido a que incrementa el contenido en calcio de las plantas y sus efectos protectores de los tejidos al hongo patógeno 'B. cinerea'. (Barkai-Golan, 2001).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto y el grado de variabilidad que presentan los distintos aislados del hongo 'Botrytis cinerea' obtenidos de plantas ornamentales a la acción del cloruro cálcico
En la actualidad, el uso registrado del CaCl2 queda restringido a poscosecha y se utiliza como un inhibidor fisiológico del acorchado de las manzanas y las peras durante su conservación frigorífica. También ha sido descrito, como se ha mencionado anteriormente, como muy efectivo para mejorar la consistencia de las paredes celulares de los tejidos vegetales y aumentar de este modo la resistencia a los ataques fúngicos.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto y el grado de variabilidad que presentan los distintos aislados del hongo 'Botrytis cinerea' obtenidos de plantas ornamentales a la acción del cloruro cálcico.

Materiales y métodos

Nuestro laboratorio dispone de una colección de aislados de 'B. cinerea' obtenidos de plantas ornamentales afectadas de 'Botrytis blight' en el sureste de España. Los aislados estudiados en el presente trabajo se obtuvieron de geranio ('Pelargonium x hortorum'), lantana ('Lantana camara'), lonicera ('Lonicera japonica'), hortensia ('Hydrangea macrophylla') y ciclamen ('Cyclamen persicum') (Fig. 1). Todas ellas muy populares y usadas frecuentemente como plantas en maceta (Sánchez-Blanco et al., 2009).
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Figura 1: Plantas ornamentales afectadas por 'Botrytis blight' en el sureste de España. (a) L. camara, (b) L. japonica, (c) C. persicum, (d) P. x hortorum, (e) H. macrophylla.
Los aislados de 'B. cinerea' de geranio, hortensia y ciclamen se obtuvieron entre enero y febrero de 2006, mientras que los aislados de lantana y lonicera se consiguieron en marzo de 2007. Se consiguió un aislado por especie vegetal. Las muestras del hongo se aislaron de las hojas de plantas infectadas o de sus tallos y se purificaron en agar de patata y dextrosa (PDA, Scharlab, Barcelona). Los aislados se identificaron a nivel de especie de acuerdo con Rigotti et al. (2002), mediante una extracción del ADN y un análisis posterior, por la técnica de PCR, de un marcador molecular específico (750-bp) presente en 'B. cinerea', pero ausente en otras especies de 'Botrytis'. La colección se mantiene realizando répicas cada tres meses y sin haber sido conservadas en refrigeración.

Una vez purificados todos los aislados, se hizo un estudio de caracterización presentado en Martínez et al. (2008). A partir de cada aislado se realizaron subcultivos en PDA a los que se agregaron CaCl2 a las siguientes concentraciones realizadas en el medio de cultivo: 0, 1, 2, 4, 8 y 16 g/l. Una vez solidificado el medio con CaCl2 se procedió a colocar un pequeño fragmento del aislado del hongo por placa que previamente había crecido en PDA durante cinco días. Se realizaron cinco placas (repeticiones) de aislado y dosis de CaCl2 y se incubaron durante 36 días a 26 °C en condiciones normales de luz de día y de noche. Debido a que solamente la concentración de 16 g/l mostró efectos significativos sobre los aislados, los resultados presentados corresponden a esta concentración.

A partir de cada aislado se realizaron subcultivos en PDA a los que se agregaron CaCl2 a las siguientes concentraciones realizadas en el medio de cultivo: 0, 1, 2, 4, 8 y 16 g/l
Se midieron las siguientes variables: crecimiento del micelio, conidiogénesis, masa del micelio aéreo y sumergido y desarrollo de esclerocios. La metodología utilizada se describe a continuación. Las colonias se chequearon todos los días para caracterizar el crecimiento, poner de manifiesto el inicio de la conidiogénesis, el inicio de la formación de esclerocios y cualquier otro carácter morfológico destacable.

El crecimiento del micelio se obtuvo a partir del área de la colonia obtenida con una cámara fotográfica digital, medida diariamente con el uso del software Image Tools 3.0 (Optika Microscopes, Barcelona). Se utilizó la tasa de crecimiento μ (cm2/día), definida como la variación de la extensión de la colonia fúngica durante un período de tiempo determinado en la fase lineal del crecimiento del hongo de acuerdo con la siguiente ecuación:

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En esta ecuación At es el área (cm2) de la colonia en el tiempo t y A[t+1] es el área del hongo tras una unidad de tiempo transcurrido hasta la siguiente fotografía (días). En este experimento [t+1] – t ha sido equivalente a 24 horas (Martínez et al., 2007). La tasa de crecimiento varía de acuerdo con la fase de crecimiento considerada y con el día seleccionado para la ecuación. Por ello, se decidió utilizar las áreas correspondientes al intervalo comprendido entre el cuarto y el quinto día de crecimiento, es decir, cuando el hongo se encontraba en pleno crecimiento (fase lineal) (Fig. 3).
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Figura 3: Aspecto del micelio de cinco aislados de 'B. cinerea' obtenidos de distintas plantas ornamentales creciendo en PDA después de 22 días a 26 °C con 0 g/L o 16 g/L de CaCl2.

La conidiogénesis empieza cuando los conidióforos y, en consecuencia, la masa de conidios, emerge del micelio aéreo. Este proceso suele cambiar el color del hongo hacia tonos grisáceos. El número de conidios producidos por colonia se determinó a los siete días, cuando las colonias alcanzaban el tono más grisáceo. No obstante, este color no fue evidente en todos los aislados debido a la variabilidad fenotípica presente. El final de la fase lineal de crecimiento fue otra variable a tener en cuenta para medir la conidiogénesis. En este momento, las placas se congelaron a -18 °C para endurecer el medio de cultivo y separar fácilmente con un bisturí el micelio aéreo del sumergido por debajo del medio. El micelio eliminado se introdujo en una bolsa de stomacher y se añadió un volumen medido de agua destilada al que añadió tween 80 a 0,01% (v/v). Tras el homogeneizado en el stomacher (Seward Medical, Reino Unido), se midió el número de conidios en una cámara de recuento Thoma (Brand, Alemania).

El resultado se extrapoló para expresarlo en número de conidios por cm2 de hongo. La masa de micelio aéreo obtenida por el procedimiento anterior, tras la fase lineal de crecimiento, se secó en una estufa a 60 °C durante seis horas antes de su pesado en una balanza de precisión (Sartorius BP221S, Göttingen, Alemania) y los resultados se expresaron como mg micelio/placa. El micelio sumergido (micelio vegetativo que crece por dentro del medio de cultivo con el fin fundamental de obtener los nutrientes) se determinó al mismo tiempo. Para ello, el bloque sólido de medio de cultivo congelado conteniendo únicamente el micelio sumergido se llevó suavemente hasta ebullición con el fin de eliminar la mayor parte del agua. Entonces, el residuo se secó completamente en la estufa utilizando las condiciones anteriormente descritas para medir la masa del micelio aéreo. El residuo seco del medio de cultivo, que corresponde a unos 780 mg (equivalente a 20 ml de medio) fue descontado al peso seco final obtenido.

La producción de esclerocios se midió por recuento en placa, una vez estos fueron identificados macroscópicamente por sus formas irregulares o esféricas de color negro intenso y de diversos tamaños comprendidos entre 1 y no más de 5 mm
La producción de esclerocios se midió por recuento en placa, una vez estos fueron identificados macroscópicamente por sus formas irregulares o esféricas de color negro intenso y de diversos tamaños comprendidos entre 1 y no más de 5 mm. Este recuento se hizo sobre micelios envejecidos tras 36 días de cultivo a 26 °C.

Las diferencias entre la aplicación de CaCl2 y los aislados, así como la interacción entre ellos fue valorada por un ANOVA de dos factores por medio del software Statgraphics Plus (StatPoint Inc., Herdon, VA). El factor aislado de 'Botrytis' tuvo cinco niveles (geranio, lantana, lonicera, hortensia y ciclamen), y el factor CaCl2 tuvo dos niveles (0 y 16 g/l). Se utilizó un aislado por planta y cuatro repeticiones por combinación de los dos tratamientos. Adicionalmente se utilizaron cuatro placas por tratamiento para obtener la conidiogénesis y masa hifal. Las medias de los tratamientos se separaron mediante el test del LSD.

Resultados y discusión

Los aislados de 'B. cinerea' presentan habitualmente una elevada variabilidad fenotípica (Beever y Weeds, 2004) y concretamente para los aislados de este estudio esta variabilidad fue definida en Martínez et al. (2008). Estos hongos fueron ordenados por Martínez et al. (2008) de acuerdo con la clasificación fenotípica de Martínez et al. (2003) en los grupos listados en la Tabla 1.

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Tabla 1: Clasificación fenotípica de los aislados de 'B. cinerea' creciendo en PDA a 26 °C.
Generalmente, las colonias de 'B. cinerea' sobre PDA crecieron inicialmente con hifas hialinas y sumergidas durante la fase lineal de crecimiento. Rápidamente comenzó a emerger el micelio aéreo de color blanco y de aspecto lanoso durante toda la fase lineal de desarrollo, mientras la tasa de crecimiento era constante. Durante esta fase y dependiendo de del aislado y la presencia de CaCl2, el micelio aéreo tomó tonalidades desde grisáceas a pardas, debido al desarrollo de los conidióforos portando las masas de conidios (aspecto grisáceo) y de hifas acintadas (aspecto pardo).

Sin embargo, los aislados de 'H. macrophylla' y 'L. camara', permanecieron típicamente blancos, debido a la escasa proliferación de conidios y de hifas acintadas. En general, los aislados de 'B. cinerea' mostraron un elevado grado de variabilidad en su cinética de crecimiento, dependiendo de la aplicación de CaCl2 (Tabla 2, Figs. 2 y 3). Este compuesto afectó al crecimiento del micelio durante la fase lineal de crecimiento de manera desigual según el tipo de aislado. El cloruro cálcico incrementó el crecimiento del aislado de 'H. macrophylla' desde 15 cm2/día (0 g/l) a 18 cm2/día (16 g/l) y retrasó el de los aislados de 'L. camara' y 'L. japonica' (Tabla 2, Fig. 3).

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Figura 2: Crecimiento del micelio de cinco aislados de 'B. cinerea' aislados de distintas plantas ornamentales creciendo en PDA a 26 °C con 0 g/l o 16 g/l de CaCl2.
El calcio es requerido por el hongo en pequeñas cantidades para el crecimiento de las hifas. Este catión está envuelto en diversas funciones, tales como la síntesis de los polímeros de la pared celular de la célula fúngica, el movimiento de vesículas dentro del citoplasma y en el crecimiento del ápice hifal. Por otro lado, la aplicación de calcio incrementa la integridad estructural de las paredes celulares de las plantas que se traduce en una reducción de infecciones causadas por hongos. Otros autores han investigado las aplicaciones in vitro de CaCl2 a varios hongos, incluido a 'B. cinerea'. Chardonnet et al. (2000), pusieron de manifiesto que esta sustancia disminuyó la longitud del tubo germinativo, redujo la germinación de conidios y afectó al crecimiento en extensión del micelio de esta especie, dependiendo del contenido en calcio.

Las fases típicas de crecimiento que se presentan en un hongo cuando crece en medio de cultivo sólido sintético pudieron ser observadas (Fig. 3). Inicialmente se presentó la fase de latencia, que se caracteriza por un nulo o escaso crecimiento y que duró casi 24 horas con o sin CaCl2. Posteriormente tuvo lugar la fase exponencial, cuya duración es tan breve que raramente se llega a poner de manifiesto en los gráficos. Esta fase dura hasta que el hongo crece unos 0,1 mm. En la fase lineal se presentaron dos tasas de crecimiento distintas. Una primera en la cual el hongo creció más despacio y duró hasta el tercer día, y otra segunda que tuvo lugar entre el tercer día y el sexto. En esta fase ocurrió la mayor tasa de crecimiento en todos los aislados, tanto en presencia de CaCl2 como sin él. Posteriormente los aislados no aumentaron prácticamente la extensión de las colonias (fase de deceleración). La influencia del calcio estuvo en los aislados de 'L. camara' y de 'L. japonica' que acortó, en los dos casos, la fase lineal de crecimiento, especialmente en este último (Tabla 2, Fig. 3). Como consecuencia, el CaCl2 retrasó la velocidad de crecimiento de estos dos aislados, si bien, finalmente el tamaño fue el mismo en todos los casos (Fig. 3). La aplicación de calcio incrementó el micelio aéreo del aislado de 'P. x hortorum' y la masa del micelio sumergido del aislado de 'H. macrophylla', pero no el de 'L. japonica' (Tabla 2). El aislado de 'C. persicum' presentó la mayor masa de micelio aéreo (296 mg/placa. Tabla 2), seguido del aislado de 'P. x hortorum'. El micelio aéreo de los aislados 'H. macrophylla', 'L. camara' y 'L. japonica' fue insignificante (entre 2 y 5 mg/placa. Tabla 2). No hubo relación directa entre la masa de micelio aéreo y la masa del micelio sumergido, a excepción del aislado de 'C. persicum', que presentó también la mayor masa de micelio sumergido (Tabla 2). Este resultado parece que contrasta con el crecimiento en extensión del micelio que tuvo tendencia a ralentizarse en algunos aislados. Sin embargo, el crecimiento en extensión de un hongo no está directamente relacionado con su masa hifal necesariamente. Una elevada masa hifal acompañado de una extensión compacta implica una masa de hifas muy cortas y ramificadas.

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Tabla 2: ANOVA del efecto del aislado de 'B. cinerea' y del CaCl2 sobre las estructuras fúngicas y el crecimiento del micelio creciendo en PDA a 26 °C.
Los conidios empezaron a aparecer en masas visibles a partir del quinto día. La mayor producción de conidios tuvo lugar en el aislado de 'C. persicum', seguido de 'P. x hortorum' (Tabla 2, Fig. 2). El color pardo-grisáceo con que se mostró el aislado de 'P. x hortorum' se debió a la elevada cantidad de hifas acintadas que aparecieron (Martínez et al., 2008). La aplicación de CaCl2, redujo tanto la producción de conidios, como la de hifas de tipo acintado en este aislado (Fig. 2). La conidiogénesis se retrasó con el uso de CaCl2, especialmente en el aislado de 'C. persicum' (cuatro veces más reducida que el tratamiento sin calcio) (Tabla 2, Fig. 2).

En relación a la producción de esclerocios, estos empezaron a aparecer a partir de los 14 días y a partir de los 30 días aproximadamente ya no aparecieron más. Los aislados que más esclerocios produjeron fueron los obtenidos de 'H. macrophylla', seguidos de 'L. japonica'. Es destacable que la aplicación de calcio redujo la producción de esclerocios en el aislado de 'H. macrophylla' (Tabla 2, Fig. 2). Este resultado es importante para el control de 'Botrytis blight', puesto que los esclerocios constituyen la mayor fuente de inóculo infectivo de 'B. cinerea' presente en el suelo.

La aplicación de calcio redujo la producción de esclerocios en el aislado de 'H. macrophylla'
La aplicación de CaCl2 a distintos aislados de 'B. cinerea' obtenidos de plantas ornamentales no tuvo grandes consecuencias sobre el crecimiento in vitro de estos. Únicamente las elevadas concentraciones de este compuesto (16 g/l) afectaron significativamente al desarrollo del hongo, que por otro lado, casi siempre fue en detrimento de su desarrollo a excepción de la masa hifal que en ocasiones pudo aumentarla dependiendo del aislado. En todas las variables de desarrollo que se analizaron, se puso de manifiesto una respuesta diferencial de algunos de los aislados, lo que confirma la elevada variabilidad fenotípica presente en ellos, tal y como ha sido reportado por los autores en otras publicaciones (Martínez y Bañón, 2007, Martínez et al., 2008, 2009, 2010, 2011a y 2011b).

Por todo ello, se concluye que los tratamientos de calcio para mejorar la resistencia de las plantas ornamentales en maceta a los ataques de 'B. cinerea', no parecen que vayan a mejorar sustancialmente la resistencia a 'Botrytis blight' cuando se busca el efecto directamente sobre el hongo. Si bien, se ha encontrado un efecto favorable a altas concentraciones en la reducción del crecimiento, producción de conidios y de esclerocios, los resultados han sido muy variables dependiendo del aislado considerado. No obstante, los efectos de la aplicación de calcio in vivo, es decir, sobre las plantas, se consideran bastante útiles para reducir la infección por medio del fortalecimiento de las paredes celulares de los vegetales y eso es un hecho constatado.

Un extracto de este trabajo fue presentado al International Congress of Postharvest Pathology celebrado en Lleida (Cataluña), del 11 al 14 de abril de 2011, bajo el título ‘Effects of calcium chloride on Botrytis cinerea isolates obtained from ornamental plants’.
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