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La citricultura española representa una de las primeras partidas de ingresos en el capítulo general de las exportaciones nacionales

Utilización de métodos clásicos y herramientas biotecnológiccas en la mejora genética del limonero: Resultados preliminares

O. Pérez-Tornero* , F. Córdoba, M. Moreno, L. Yuste e I. Porras, del Departamento de Citricultura del Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario (Imida)

*(olalla.perez@carm.es)

09/05/2011

9 de mayo de 2011

España, con la Región de Murcia al frente, es el país productor de limones más importante de la cuenca Mediterránea. En el mercado internacional de cítricos, la competencia está aumentando drásticamente y el mantenimiento de la producción y la competitividad de la citricultura española depende ampliamente de la disponibilidad de variedades nuevas y mejoradas que respondan al incremento de la demanda de fruta de alta calidad de los mercados. En el caso del limonero, el impulso de un Programa de Mejora Genética es fundamental para el desarrollo económico de la citricultura de nuestro país y en concreto para la recuperación del limón durante los meses de verano con la posibilidad de competir con los limones que vienen de otros países como Argentina o Turquía.
España es el primer exportador mundial de frutos cítricos (FAO 2008). De hecho, la citricultura española representa una de las primeras partidas de ingresos en el capítulo general de las exportaciones nacionales. Dentro de los cítricos, el limonero (Citrus limon (L.) Burm. f) es la tercera especie de cítricos en importancia en el mundo después del naranjo y el mandarino, siendo España, con la Región de Murcia al frente, el principal país productor de limones de la Cuenca Mediterránea.

La producción de limoneros en España está basada esencialmente en dos variedades autóctonas ‘Fino’ y ‘Verna’ las cuales representan más del 97% del total de la superficie de cultivo de limón. El limonero ‘Fino’, de excelente calidad, tiene su periodo de recolección óptimo de septiembre a marzo, mientras que el de ‘Verna’ se extiende de marzo a julio. Esta situación es peligrosa ya que durante los meses de verano se produce una fuerte competencia con los limones que vienen de otros países como Turquía y especialmente Argentina con sus limones ‘Eureka’, ‘Lisbon’ y ‘Génova’ (Porras, et al., 2001). Hasta ahora ese hueco de mercado lo cubría el limonero ‘Verna’, pero sus frutos son de inferior calidad que los ‘Finos’. Además, su escasa producción ha hecho que su rentabilidad sea muy baja y por tanto se abandone su cultivo y no se realicen nuevas plantaciones (García Lidón et al., 2003).

La producción de limoneros en España está basada esencialmente en dos variedades autóctonas, ‘Fino’ y ‘Verna’, las cuales representan más del 97% del total de la superficie de cultivo de limón
La ausencia de semillas es una de las características más importantes y demandadas por el mercado de fruta fresca (Davies y Albrigo, 1994). La mayoría de los cítricos cultivados son diploides (2n=2x= 18) aunque ocasionalmente aneuploidías y euploidías pueden ser encontradas en las plantas de semilla. Las variaciones de euploidía más comunes en cítricos son las plantas triploides y tetraploides (Lee, 1988). La triploidía en plantas lleva asociado generalmente esterilidad (Geraci et al., 1975; Esen et al., 1978) lo que produce un aumento del interés de los mejoradores de cítricos por llevar a cabo estrategias que permitan el desarrollo de variedades triploides sin semillas (Ollitrault et al., 2008) ya que, como en cítricos la partenocarpia es un fenómeno común, la formación de semillas no es necesaria para la obtención de buenas producciones.

El objetivo principal de este trabajo es comenzar un programa de mejora genética de limonero para obtener clones de limonero de calidad y que produzcan frutos sin semillas, usando diferentes variedes de limoneros tipo ‘Verna’ y ‘Fino’ como progenitores.

Materiales y métodos: Polinizaciones controladas entre diferentes variedades de limonero

Durante la primavera de los años 2008 y 2009 se llevaron a cabo diferentes cruzamientos controlados entre ‘Verna 51’ (madre) y ‘Fino 49’ o ‘Fino 95’ (dadores de polen) (Tabla 1). La elección de ‘Verna 51’ como madre estuvo basada en que este clon de limonero produce un menor número de semillas poliembriónicas, según los resultados obtenidos previamente por Pérez-Tornero y Porras (2008). Las yemas florales de los parentales fueron seleccionadas considerando su proximidad a la antesis. El polen fue deshidratado y guardado a 4 °C hasta su uso. Las flores de ‘Verna 51’, próximas a la antesis, fueron emasculadas y polinizadas con un pincel cargado con el polen de los parentales (Figura 1) y cada flor se etiquetó con la fecha y el parental de polinización. Los frutos fueron recogidos unos 120 días después de la polinización y los embriones se extrajeron y germinaron usando el método de rescate y cultivo de embriones inmaduros establecido por Pérez-Tornero y Porras (2008). Para ello, los frutos fueron lavados con agua y jabón para pasar a continuación a sumergirlos durante 30 minutos en una solución al 20% de lejía comercial con detergente (5.25% NaOCl) en agitación para su desinfección.
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Figura 1: Hibridaciones en campo entre distintas variedades de limonero.
El procesado de los frutos se llevo a cabo en condiciones estériles en una cabina de flujo laminar (Figura 2). La extracción de los embriones se efectuó bajo una lupa usando bisturí y pinzas. Los embriones fueron escindidos desde el extremo micropilar de la semilla después de eliminar la cubierta con un corte longitudinal (Figura 3), y fueron cultivados en placas Petri en el Medio de Germinación (Figura 4) para pasar después de 15-20 días al Medio de crecimiento en tubos de ensayo (Figura 5).
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Figura 2: Proceso de extracción de las semillas inmaduras de limonero, en condiciones estériles en la cabina de flujo laminar, desde frutos de limonero después de unos 120 días después de la polinización.
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Figura 3: Extracción del embrión de una semilla inmadura de limonero. La flecha indica la posición del embrión.
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Figura 4: Distintas etapas en la germinación de embriones de limonero.
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Figura 5: Embriones de limonero en fase de crecimiento.
En este momento se cultivaron por separado los embriones procedentes de semillas poliembriónicas de las monoembriónicas. Después de la germinación y el crecimiento inicial, las plántulas fueron transferidas a bandejas de alveolos conteniendo una mezcla de turba y perlita (2:1) y aclimatadas en la cámara de cultivo (Figura 6).
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Figura 6: Plántulas de limonero aclimatadas en la cámara de cultivo.

Materiales y métodos: Selección de plantas tetra- o triploides

Para la selección de plantas triploides o tetraploides desde las polinizaciones controladas todas las plantas procedentes de los cruzamientos se analizaron por citometría de flujo. Para ello, se cogió una muestra de una hoja por planta y se analizaron las hojas en grupos de 10 plántulas. Cuando se detectó una muestra con núcleos triploides se analizaron todas las hojas de esa muestra por separado para seleccionar la planta poliploide. Las muestras fueron trituradas utilizando una cuchilla en presencia de tampón de extracción de núcleos (Partec CyStain UV precise P). Posteriormente, la mezcla fue filtrada a través de un filtro de 50µm y se añadió el tampón de tinción de núcleos (Partec CyStain UV precise P). Después de 5 minutos de incubación, las muestras teñidas fueron analizadas en un citómetro de flujo equipado con una fuente de luz ultravioleta Partec PA II (Partec GMBH, Münster, Alemania).
Para la selección de plantas triploides o tetraploides desde las polinizaciones controladas todas las plantas procedentes de los cruzamientos se analizaron por citometría de flujo
También se llevó a cabo la selección de plantas poliploides desde varios semilleros de limoneros tipo ‘Verna’ y tipo ‘Fino’ (Tabla 3). Con este fin, semillas de frutos maduros fueron lavadas con agua y jabón y desinfectadas en una disolución de lejía al 20%, con unas gotas de detergente, durante 20 minutos. La siembra se llevó a cabo en bandejas con vermiculita estéril, después de eliminar los tegumentos de las semillas. El cultivo de las semillas se realizó en la cámara de cultivo. Cuando las plantas tuvieron dos hojas expandidas, a partir de las hojas cotiledonares (Figura 7), se cogió una muestra de una hoja por planta y se analizaron siguiendo el protocolo anterior. Las plantas poliploides fueron plantadas en macetas, con sustrato, y crecidas en el invernadero.
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Figura 7: Germinación de semillas maduras de limonero en bandejas con vermiculita.

Resultados y discusión: Polinizaciones controladas entre diferentes variedades de limonero

Durante la primavera de los años 2008 y 2009 se realizaron unos 600 cruzamientos controlados entre ‘Verna 51’, utilizado como madre, y dos clones de ‘Fino’ (49 y 95), utilizados como dadores de polen. El número de flores y el porcentaje de fructificación de cada cruzamiento fueron diferentes según el dador de polen y el año (Tabla 1). El porcentaje de fructificación fue más alto con ‘Fino 49’ en 2008 pero fue menor que con ‘Fino 95’ en 2009.

La poliembrionía es uno de los principales obstáculos en la mejora de los cítricos por métodos convencionales. La mayoría de las variedades de limonero producen un substancial número de embriones por semilla (Pérez-Tornero y Porras, 2008) y el embrión cigótico tienes importantes dificultades para sobrevivir (Frost y Soost, 1968) ya que debe competir por los nutrientes y el espacio con los embriones desarrollados a partir del tejido nucelar (Soost y Rose, 1996). Por este motivo, el rescate y cultivo in vitro de los embriones en estado inmaduro es una herramienta útil en la mejora de limonero, ya que asegura la germinación del embrión híbrido (Pérez-Tornero y Porras, 2008).

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Tabla 1: Resultados de la polinización controlada entre ‘Verna 51’ (madre) y ‘Fino 49’ o ‘Fino 95’ (parentales dadores de polen).
A través del rescate de embriones, un total de 160 líneas en 2008 y 36 en 2009 fueron obtenidas desde el cruzamiento‘Verna 51’ x ‘Fino 49’, mientras que un total de 39 líneas en 2008 y 62 líneas en 2009 fueron obtenidas desde el cruzamiento ‘Verna 51’ x ‘Fino 95’ (Tabla 1). Las plantas de 2008 han crecido bien en el invernadero pero la supervivencia de los descendientes de los cruzamientos de 2009 ha sido de un 50%.

Del total de plantas, aproximadamente el 50 % vienen de semillas poliembriónicas (Tabla 1), así que deberán ser analizadas por marcadores moleculares para seleccionar las plantas de origen cigótico. Todos los híbridos serán cultivados en el campo para su posterior evaluación.

Resultados y discusión: Selección de plantas tetra- o triploides

Las plantas triploides han despertado gran interés entre los mejoradores de cítricos ya que producen frutos sin semillas (Ollitrault et al., 2008). Las plantas triploides pueden ser seleccionadas directamente desde cruzamientos entre dos genotipos diploides (Esen y Soost, 1973) o por hibridación entre parentales diploides y tetraploides (Navarro et al., 2002). En cítricos se tiene constancia de la producción de triploides y tetraploides espontáneos (Soost and Roose, 1996), producidos desde cruzamientos entre genotipos diploides, aunque este proceso ocurre en muy bajos porcentajes (Russo, 1985).

En semillas triploides, el desequilibrio en el número de cromosomas entre el embrión y el endospermo altera la relación entre ellos produciendo la degeneración del endospermo y el consiguiente aborto del embrión (Esen y Soost, 1973). Por ello se hace necesario el rescate de los embriones en estado inmaduro. La aplicación de esta técnica a los embriones procedentes de los cruzamientos permitió la recuperación de un 5.8-8.6% de progenie triploide en 2008 y 16.2-28.6% de progenie tetraploide en 2009 (Tabla 2).

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Tabla 2: Niveles de ploidía en semillas obtenidad desde polinización controlada entre ‘Verna 51’ (madre) y ‘Fino 49’ o ‘Fino 95’ (progenitores dadores de polen).
El análisis por citometría de flujo de plántulas de semilla de distintos tipos de limonero mostró que 1-1,6% de ellas fueron triploides y 0,4-1,2% tetraploides (Tabla 3). Estos valores tan bajos coinciden con los obtenidos por Russo (1985), y hacen que sea necesario analizar cientos de plantas para poder seleccionar unos pocos poliploides. Pero, cuando no se dispone de plantas tretaploides de calidad para obtener triploides, por hibridación entre un progenitor diploide y otro tetraploide, el análisis de plántulas de semilla es un método útil.
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Tabla 3: Niveles de ploidía observados desde el análisis de plántulas de semilla de diferentes tipos de limonero.
Todas las plantas triploides y tetraploides seleccionadas en este estudio están creciendo en el invernadero y algunas de ellas han sido injertadas sobre patrones para su posterior evaluación en el campo (Figura 8).
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Figura 8: Selección triploide de limonero tipo ‘Verna’ injertado sobre un patrón.
Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por el Instituto de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario, a través del proyecto CARM PO07-012, el European Social Funds y FEDER.

Bibliografía

- Davies, F.S.y Albrigo, L.G. (1994) Citrus. CABI, Wallingford, UK.

- Esen A. y Soost R.K. (1973) Precocious development and germination of spontaneous triploid seeds in Citrus. J Hered 64:147–154

- Esen A., Soost R.K. y Geraci G (1978) Seed set, size and development after 4x–2x and 4x–4x crosses in Citrus. Euphytica 27:283–293

- Frost H.B. y Soost R.K. (1968). Seed reproduction: Development of gametes and embryos. pp. 290-324. En: W.Reuther, L.D. Batchelor and H.J. Webber (eds.), The Citrus Ind., Vol 2. Univ. of Calif. Press, Berkeley

- García Lidón A., Del Río J.A., Porras I., Fuster M.D.y Ortuño A. (2003). El limón y sus componentes bioactivos. Serie Técnica y de Estudios Nº 25. Conserjería de Agricultura, Agua y Medio Ambiente. Murcia. 127 pp

- Geraci G., Esen A., Soost R.K. (1975). Triploid progenies from 2x–2x crosses of Citrus cultivars. J Hered 66:177–178

- Lee L.S. (1988) Citrus polyploidy. Origins and potential for cultivar improvement. Aust J Agric Res 39:735–747

- Navarro L., Juárez J., Aleza P. y Pina J.A. (2002). Recovery of triploid seedless mandarin hybrids from 2n x 2n and 2n x 4n crosses by embryo rescue and flow cytometry. In: Proceedings of the 10th IAPTC&B Congress, plant biotechnology 2002 and beyond. Orlando, pp 541–544.

- Ollitrault P., Dambier D., Luro F. y Froelicher Y. (2008). Ploidy manipulation for breeding seedless triploid citrus. Plant Breed Rev 20:323–354

- Pérez-Tornero O. y Porras I. (2008). Assessment of polyembryony in lemon: rescue and in vitro culture of immature embryos. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture 93 (2): 173-180

- Porras I, García Lidón M. y Pérez Hernández, F. (2001). Citricultura en la Región de Murcia. Agrícola Vergel, 20(5): 238-251.

- Russo, F. (1985). Genetica e miglioramiento. En: Trattato di Agrumicoltura, 9: 241-287. Edagricole. Bolonia.

- Soost, R.K. and Roose, M.L. (1996) Citrus. En: Janick, J. y Moore, J.N. (eds.) Fruit Breeding. Vol. I. Tree and Tropical Fruits. John Wiley and Sons, New York.

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