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Desarrollados por primera vez marcadores moleculares que permiten una selección de los híbridos resistentes en los primeros estados de su desarrollo

Genética de la susceptibilidad de los mandarinos al hongo Alternaria alternata

Cuenca J., Garcia-Lor A., Hernández M., Navarro L., Aleza P.

Centro de Citricultura y Producción Vegetal - Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

12/06/2018

La mancha marrón de las mandarinas causada por el hongo Alternaria alternata es una importante enfermedad que limita el cultivo de variedades susceptibles. Los últimos avances en el conocimiento sobre los mecanismos genéticos que determinan la susceptibilidad a la enfermedad permiten actualmente desarrollar programas de mejora altamente eficientes para la obtención de nuevos híbridos resistentes. En los últimos años, el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del IVIA ha desarrollado por primera vez marcadores moleculares que permiten una selección de los híbridos resistentes en los primeros estados de su desarrollo mediante el análisis de su ADN, mejorando las técnicas de evaluación de la resistencia disponibles hasta el momento. De esta forma, se asegura que los híbridos disponibles para evaluar en campo son resistentes a la enfermedad. Además, estos marcadores permiten la selección de parentales que transmitan la resistencia a los nuevos híbridos.

La mancha marrón de las mandarinas (ABS)

La mancha marrón de las mandarinas producida por el hongo Alternaria alternata (ABS, por su nombre en inglés 'Alternaria brown spot') se describió por primera vez en Australia en 1903 y actualmente está presente en las principales zonas citrícolas del mundo. En España, la enfermedad se detectó por primera vez en Alzira (Valencia) en 1998 y rápidamente se extendió a todas las áreas citrícolas peninsulares. Actualmente, la enfermedad ABS se ha convertido en un factor limitante para el cultivo de variedades sensibles en algunas zonas de producción (Vicent et al., 2008). ABS afecta a los frutos, hojas y brotes de las variedades susceptibles. Las hojas jóvenes son muy sensibles a la enfermedad mostrando áreas necróticas que avanzan siguiendo las nervaduras de las hojas. Suelen presentar un halo clorótico a su alrededor ocasionando la caída de las hojas. Los frutos afectados presentan depresiones necróticas y pústulas suberosas en la corteza. Estas lesiones están restringidas a la corteza de los frutos que los deprecia comercialmente para su consumo en fresco. Además, los frutos pueden sufrir una abscisión prematura, lo que reduce notablemente la producción.

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El hongo Alternaria alternata se reproduce mediante esporas sobre las lesiones producidas bajo las condiciones adecuadas, durando este proceso entre 10 y 40 días (Reis et al., 2006). Las esporas se diseminan principalmente a través del aire y la lluvia (Timmer et al., 1998). El hongo puede infectar con temperaturas entre 17 y 32 °C cuando se producen entre 8 y 12 horas de humectación. Las esporas emiten la toxina ACT (responsable de la infección) en el momento de la germinación, por lo que la aparición de síntomas se produce después de16-36 horas (Canihos et al., 1999; Timmer et al., 2000). Los períodos críticos de infección están determinados principalmente por la presencia de condiciones climáticas favorables y tejido vegetal susceptible. Las hojas sólo se ven afectadas por la enfermedad durante sus primeras fases de desarrollo, mientras que los frutos de algunas variedades muy susceptibles como 'Fortune' pueden infectarse en cualquier estado de desarrollo. En nuestras condiciones, los principales períodos de infección se dan en primavera y finales de verano-otoño, aunque pueden variar según las condiciones climáticas propias de cada año (Vicent et al., 2004).

Genética de la resistencia a ABS

Durante los últimos años, el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del IVIA está desarrollando un proyecto para ampliar el conocimiento sobre los mecanismos genéticos implicados en la resistencia. Se han desarrollado diferentes tipos de marcadores moleculares que permiten identificar variedades comerciales, parentales e híbridos resistentes a la enfermedad aumentando enormemente la eficiencia del programa de mejora genética.

Comercialmente, podemos encontrar variedades susceptibles a ABS en mayor o menor grado, y variedades resistentes. El mandarino 'Dancy' y los híbridos derivados de éste, como 'Fortune', 'Nova', 'Minneola', 'Page', 'Orlando', 'Lee', 'Sunburst', 'Tahoe Gold', 'Shasta Gold' o 'Yosemite Gold' son susceptibles a la mancha marrón, aunque con diferentes grados de susceptibilidad. Por otro lado, existen también variedades susceptibles a ABS que no tienen 'Dancy' en su pedigree, como son las mandarinas 'Murcott', 'Primosole', 'Ponkan' o 'Emperor', así como algunas variedades de pomelo. Cabe destacar que las mutaciones espontáneas o inducidas de las variedades susceptibles a ABS son, por lo general, también susceptibles, como 'Mor' o 'Murina' (mutaciones de 'Murcott'), y 'Nova SL' (mutación de 'Nova'). Sin embargo, es posible obtener híbridos resistentes derivados de algunas de estas variedades susceptibles, como 'Safor' ('Fortune' X 'Kara'), 'Garbi' ('Fortune' X 'Murcott') o 'Nadorcott' (híbrido de 'Murcott'). Entre las variedades resistentes encontramos, entre otras, las clementinas, las satsumas, y otras variedades de mandarino, como 'Kara' o el 'Mandarino Común'.

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Genéticamente, la susceptibilidad a ABS está controlada por un alelo dominante (A) de un solo gen. Por tanto, las variedades resistentes presentan los dos alelos recesivos (aa), mientras que las variedades susceptibles pueden presentar un alelo de susceptibilidad (Aa) o dos (AA) (Cuenca et al., 2013). Las variedades de tipo AA, como son 'Dancy' y 'Minneola', transmiten la sensibilidad a toda su descendencia, de forma que todos los híbridos directos obtenidos a partir de ellas serán susceptibles a ABS, independientemente del otro parental utilizado en el cruzamiento. Las variedades resistentes (aa) producen todos sus híbridos resistentes cuando se cruzan entre sí, aunque esta estrategia limita notablemente el número de posibles parentales a utilizar, lo que puede conllevar a prescindir de algunas características agronómicas y organolépticas importantes presentes en estas variedades. (Navarro et al., 2015). La mayoría de las variedades susceptibles a ABS cultivadas comercialmente presentan una configuración genética Aa, como es el caso de 'Fortune', 'Nova' o 'Murcott', por lo que en las poblaciones de híbridos obtenidas a partir de estas variedades se pueden encontrar individuos resistentes y susceptibles. Estas consideraciones son aplicables a programas de mejora genética basados tanto en obtención de híbridos diploides como triploides.

Sin embargo, las proporciones entre híbridos susceptibles y resistentes que se obtienen de cada cruzamiento varían según la estrategia utilizada. A nivel diploide, la herencia de la susceptibilidad sigue una segregación mendeliana clásica, de forma que estas proporciones son previsibles y relativamente sencillas de calcular. En cuanto a la estrategia de obtención de híbridos triploides, en nuestro grupo hemos desarrollado prácticamente todo el conocimiento sobre la genética de la susceptibilidad a ABS que se trasmite en las poblaciones triploides. En este caso, las proporciones entre híbridos triploides susceptibles y resistentes que se obtienen dependen de (i) el tipo de estrategia empleada en la obtención de los híbridos triploides (diploide X diploide, tetraploide X diploide o diploide X tetraploide); (ii) en el caso de cruzamientos diploide X diploide, del mecanismo de origen (SDR o FDR) de los híbridos triploides obtenidos y (iii) de la posición del gen responsable de la susceptibilidad a ABS dentro del cromosoma. En nuestro grupo hemos demostrado que el mecanismo de origen de los híbridos triploides obtenidos en cruzamientos diploide X diploide es mayoritariamente de tipo SDR, transmitiendo doble información del parental femenino (Cuenca et al., 2011; 2015) y hemos localizado el gen responsable de la susceptibilidad a ABS a 10 cM del centrómero en el cromosoma III del mapa genético de los cítricos (Cuenca et al., 2013). Toda esta información nos permite actualmente estimar las proporciones de híbridos susceptibles y resistentes que se van a obtener en cada tipo de cruzamiento (Tabla 1) y, por tanto, seleccionar la estrategia más adecuada para la obtención de híbridos triploides resistentes a Alternaria.

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Tabla 1. Proporciones de híbridos diploides y triploides susceptibles y resistentes esperados en cada tipo de cruzamiento.

Métodos biológicos de evaluación de resistencia a ABS

Para la evaluación de la respuesta de las variedades a la infección por el hongo, se realizan generalmente tres ensayos. El primer ensayo consiste en la observación de síntomas en hojas y frutos en árboles cultivados en campo con un alto nivel de inóculo. Estos ensayos de campo permiten cuantificar el grado de susceptibilidad de las variedades sensibles, además de identificar las variedades que no muestran ningún síntoma. En el IVIA se dispone de parcelas diseñadas específicamente para inducir condiciones altamente favorables para la enfermedad con una elevada presión de inóculo. Sin embargo, el desarrollo epidémico de la enfermedad sobre una variedad en campo depende de otros factores, además de la susceptibilidad genética, como son la capacidad de esporulación en las lesiones y la duración del período infectivo (Reis et al., 2007; Vicent et al., 2008). El segundo ensayo de respuesta a ABS consiste en la inoculación in vitro de hojas jóvenes mediante una solución de esporas del hongo. Este ensayo es relativamente rápido y sencillo, permitiendo obtener resultados en 48-72 horas. Sin embargo, se requiere disponer de hojas en un estado de desarrollo adecuado para favorecer la infección. Cabe destacar que esta técnica es muy agresiva, por lo que algunas variedades resistentes podrían mostrar algunas pequeñas reacciones de susceptibilidad. No obstante, si no se observan síntomas en estos ensayos, se puede afirmar que la variedad será resistente en condiciones de campo (Vicent et al., 2004). El tercer ensayo consiste en la inoculación con una solución de esporas del hongo sobre plantones con brotaciones jóvenes uniformes y posterior incubación durante varios días en condiciones favorables para el desarrollo de la enfermedad. Esta metodología es más fiable que las inoculaciones de hojas in vitro, ya que permite identificar claramente tanto las variedades sensibles como las resistentes (Vicent et al. 2012).

Desarrollo de marcadores moleculares para la selección de híbridos resistentes a ABS

Para mejorar la eficiencia y rapidez en la selección de híbridos resistentes dentro del programa de mejora genética de mandarinos del IVIA, se han desarrollado por primera vez marcadores moleculares asociados a la resistencia a ABS. Para ello, se evaluó la respuesta a la enfermedad de tres poblaciones de híbridos diploides y triploides obtenidos mediante cruzamientos entre el parental susceptible 'Fortune' y una variedad resistente (Aa X aa). En una primera fase, los híbridos triploides fueron analizados mediante un panel de 1.536 marcadores moleculares de tipo SNP (Single Nucleotide Polymorphism), detectando una región en el cromosoma III altamente ligada a la respuesta de los híbridos a la enfermedad. En el siguiente paso se desarrollaron nuevos marcadores moleculares en la región identificada para analizar una población diploide. Los resultados obtenidos permitieron identificar una región de 3,3 Mb cerca del centrómero del cromosoma III asociada con la susceptibilidad a ABS, y se identificaron dos marcadores a ambos lados del gen (Cuenca et al., 2013). Finalmente, se desarrollaron nuevos marcadores de tipo SNP entre los dos marcadores identificados previamente, que fueron analizados en una población de 300 híbridos diploides con el fin de realizar un mapeo fino de la región. Como resultado, se redujo la región asociada a la susceptibilidad a ABS a 266 kb y se identificaron marcadores a 0,4 cM y 0,7 cM a ambos lados del gen. El marcador más próximo al gen, SNP08, fue desarrollado para su utilización como marcador de selección de híbridos resistentes a ABS (Cuenca et al., 2016). Este marcador permite una eficiencia de selección del 99.6%, es decir, sólo en 4 de cada 1.000 híbridos analizados el resultado obtenido no se correspondería con la respuesta del híbrido a la infección por Alternaria. Además, si se utiliza conjuntamente con otro marcador cercano al gen, la eficiencia de selección aumenta hasta el 99,97%. La utilización de este marcador molecular permite descartar los híbridos susceptibles dentro de las poblaciones obtenidas; sin embargo, no permite discriminar entre diferentes grados de susceptibilidad que puedan existir en los diferentes híbridos, por lo que potencialmente se descartan híbridos que genéticamente son susceptibles, aunque su cultivo en campo no supusiera un problema debido a su baja sensibilidad. No obstante, este marcador permite la selección de híbridos genéticamente resistentes y se asegura que no mostrarán síntomas de la enfermedad producida por los patotipos de Alternaria alternata conocidos actualmente.

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El marcador SNP08 se ha utilizado para caracterizar los parentales que se emplean en los programas de mejora genética de cítricos, ofreciendo una perfecta correlación entre el resultado obtenido y la respuesta de las variedades a ABS tanto en campo como en inoculaciones in vitro. Además, permite identificar aquellas variedades que contienen el gen de susceptibilidad a ABS en homocigosis, de tipo AA, y descartarlos como parentales en los futuros cruzamientos. Todos los nuevos híbridos del programa de obtención de mandarinos diploides y triploides del IVIA se analizan utilizando este marcador en fases muy tempranas del desarrollo de las plantas, lo que permite descartar aquéllos que son susceptibles a ABS (Figura 1). De esta forma, se evita el cultivo y la evaluación en campo de miles de híbridos (más de 4.000 hasta el momento) que serían descartados posteriormente por su sensibilidad a la enfermedad. Este marcador se ha utilizado también para analizar la respuesta a ABS de las variedades triploides obtenidas anteriormente al desarrollo del mismo, además de realizar los ensayos in vitro y la evaluación comparada con variedades de susceptibilidad conocida como 'Fortune', 'Nova' y 'Murcott', durante varios años en las parcelas de ensayos. Con todas estas evaluaciones, se conoce perfectamente la respuesta ABS antes de su distribución comercial.

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Figura 1. Resultados de los análisis mediante el marcador molecular SNP08 que permite la discriminación entre variedades resistentes y susceptibles, identificando la presencia de los alelos del gen de susceptibilidad a ABS de tipo AA y de tipo Aa. (I) Análisis de diferentes variedades comerciales; (II) Análisis de una población de 60 híbridos triploides procedente de un cruzamiento Aa X aa, obteniendo un 38% de híbridos resistentes.

Como se ha mencionado anteriormente, el desarrollo epidémico de la enfermedad sobre una variedad en campo depende principalmente de la susceptibilidad genética, aunque también influyen otros factores, como la capacidad de esporulación en las lesiones y la duración del período de infección. En este sentido, cabe mencionar la reacción a ABS de los naranjos dulces y pomelos. Estas variedades no muestran generalmente síntomas de Alternaria en campo, ni en hojas ni en frutos. Sin embargo, los análisis mediante marcadores moleculares ligados a la enfermedad muestran que son genéticamente susceptibles. Este resultado nos ha llevado a evaluar de una forma más exhaustiva la reacción de este grupo de variedades a ABS, realizando ensayos mediante inoculaciones in vitro, así como el análisis de poblaciones de híbridos obtenidos a partir de cruzamientos entre naranjas dulces y otros parentales del grupo de mandarinos que son resistentes. Los resultados obtenidos en los ensayos in vitro indican que las variedades de naranjas y pomelos analizadas muestran síntomas de la enfermedad, confirmando la susceptibilidad genética de las variedades de estos grupos (Figura 2). Además, en las poblaciones de híbridos obtenidas se observa una segregación en la respuesta a ABS, observándose híbridos resistentes y susceptibles en una proporción que se ajusta a la presencia del gen de susceptibilidad en naranjos en heterocigosis (Aa). Por tanto, aunque las naranjas no muestren síntomas de Alternaria en condiciones de cultivo en campo, y la presencia del hongo no supone ningún problema para su cultivo, hay que tener en cuenta estas consideraciones a la hora de utilizar estas variedades como parentales en los programas de mejora genética de mandarinos.

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Figura 2. Ensayo de inoculaciones in vitro con esporas de Alternaria alternata de algunos naranjos dulces y un pomelo.

Bibliografía

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