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Diversos estudios han demostrado que algunas fitocistatinas actúan como agentes de defensa frente a plagas y enfermedades

Evaluación de un activo proteómico como agente de control frente a araña roja (Tetranychus urticae)

Francisco Espinosa, Puig Mora, Jordi Espuny y Javi Nácher, del Departamento I+D+i de Seipasa

30/04/2014
El uso y aplicación de productos de origen natural con propiedades insecticidas representa una atractiva y eficiente alternativa para el control de plagas. Dentro de la estrategia de Seipasa para la obtención de una nueva generación de fitosanitarios, se incluye el uso de determinados compuestos naturales de origen proteico, más concretamente un péptido perteneciente a un grupo de proteínas identificadas en animales, plantas y algunos microorganismos que inhiben cisteín proteasas.

Descripción de la sustancia a ensayar

Diversos estudios han demostrado que algunas fitocistatinas actúan como agentes de defensa frente a plagas y enfermedades; además, juegan un papel importante a nivel endógeno relacionado con el intercambio proteico y la muerte celular programada. Dichas moléculas actúan como inhibidores de proteasas y son por lo general proteínas de pequeño tamaño. Se han identificado en tejidos de reserva de semillas y tubérculos además de estar presentes en ciertos órganos aéreos de diversas plantas (De Leo y col., 2002). También se ha podido demostrar que existe un proceso de inducción en la síntesis de estos compuestos por parte de las plantas como respuesta al daño producido por artrópodos y patógenos (Ryan, 1990).

Las fitocistatinas están llamadas a ser un significativo agente de control y pueden desempeñar un papel importante en las estrategias de defensa de las plantas, ya que además de regular las pro-teasas endógenas son capaces de interferir en el proceso digestivo de los artrópodos fitófagos cau-sando una reducción de la disponibilidad de aminoácidos necesarios para su crecimiento y desa-rrollo (Lawrence y Koundal, 2002).

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Detalle de la intensidad del ataque de araña roja. Flores y principio de la formación de vainas.

En relación con su función de defensa, se han estudiado los efectos de una cistatina sobre la araña roja (Tetranychus urticae), perteneciente al orden Acari y a la familia Tetranychidae. Se trata de un ácaro fitófago y muy polífago del que se tiene constancia que ataca a más de 200 especies vegetales, muchas de ellas con interés agrícola, siendo sus enzimas digestivos más abundantes de tipo cisteín proteasa, dianas potenciales de las cistatinas. Los ensayos de inhibición con PhyCys purificada como proteína expresada en Escherichia coli, han demostrado que esta proteína es capaz de inhibir las cisteín proteasas presentes en los tractos salivares y digestivos de este artrópodo fitófago.

El resultado obtenido indica que la PhyCys actúa como una proteína antimetabólica que interfiere en el proceso de digestión del ácaro, produciendo una disminución de la asimilación de aminoácidos esenciales y por tanto se revela como una herramienta útil para el desarrollo de acaricidas contra esta especie.

Seipasa realizó la producción de un extracto rico en PhyCys, disponiendo para ello de una cepa propia de E. coli modificada genéticamente para expresar la PhyCys. Según nuestros ensayos, la purificación no es necesaria para conseguir extractos celulares con una actividad suficientemente elevada como para ser utilizada en las pruebas de campo. Posteriormente se repitieron los pasos del protocolo de cultivo y condiciones de inducción en matraz, junto con la lisis y liofilización del extracto celular sobre la misma cepa de E. Coli pero sin modificar, con el fin de evaluar la actividad del extracto sin inducción de PhyCys frente a la actividad del extracto proteico donde se ha expresado la proteína a evaluar.

Puesto que la eficacia de la proteína reside en la ingestión de esta por parte del ácaro, cada una de las tesis a comparar se aplicó sola y junto con un tensioactivo de la familia de los alquilpoliglucósidos (caracterizados por su perfil ‘verde’) que asegurase una correcta distribución de la proteína sobre la superficie foliar.

Materiales y Métodos

Localización

Centro experimental de Seipasa. Sector 13. L’Alcudia (Valencia). Ensayo realizado a finales de verano de 2013.

Objetivos

Determinación de la actividad específica, eficacia y selectividad de un grupo de proteínas presentes en el extracto proteico EP-506 para evaluar la capacidad de control sobre poblaciones de T. urticae.

Diseño experimental

El cultivo escogido para estudiar la eficacia del extracto proteico PhyCys fue un cultivar enano de judía conocido como Red Kinsey; sus propiedades agronómicas ofrecían una serie de ventajas experimentales tales como la velocidad de crecimiento, la susceptibilidad frente a araña roja y un manejo más sencillo en las evaluaciones de individuos vivos.

El cultivo se sembró en maceta y fue criado en condiciones controladas de riego y nutrición con tal de obtener un estado sanitario y de desarrollo óptimo. El diseño experimental se realizó en bloques al azar con 7 tratamientos y 4 repeticiones de forma que permitiera conocer, por análisis comparativo, el efecto antialimenticio debido única y exclusivamente a la actividad de un grupo concreto de proteínas.

Cuando se evalúa por primera vez un activo de dichas características, bien caracterizado a nivel de laboratorio, resulta necesario descartar los efectos que sobre la plaga pudiera tener cualquier otra variable como la humedad, el efecto de una formulación fitosanitaria elaborada (empleo de tensioactivos, potenciadores, penetrantes, etc.), los efectos sinérgicos de diversas proteínas presentes también en el extracto, etc.

Por este motivo la relación de tesis a evaluar se diseñó como sigue:

  • Tratamiento 1: Agua (Water): para evaluar el efecto que los aumentos de humedad pueden tener sobre la población plaga.
  • Tratamiento 2: Agua + tensioactivo (Water + EU 0,04%): para evaluar el efecto que sobre la plaga pudiera tener este tipo de coformulante a una concentración de 0,04%.
  • Tratamiento 3: Extracto proteico de control (Control): conjunto de proteínas sin la expresión de los elementos activos para el control de la plaga.
  • Tratamiento 4: Extracto proteico de control + tensioactivo (Control + EU 0,04%): añadiendo al extracto anterior (T3) el coformulante escogido a la misma proporción.
  • Tratamiento 5: Extracto proteico PhyCys (PhyCys): se trata del mismo conjunto de proteínas que en el caso del extracto control pero habiéndose expresado el grupo de proteínas de interés.
  • Tratamiento 6: Extracto proteico EP-506 + tensioactivo (PhyCys + EU 0,04%): siguiendo la formula anterior se añadiría la misma cantidad de tensioactivo al extracto proteico de estudio.
  • Tratamiento 7: Testigo sin tratar (UTC).

Las tesis a comparar así como las dosis empleadas y número de aplicaciones se detallan en la tabla 1. Las aplicaciones se realizaron con un pulverizador de presión manual y con un gasto medio de caldo equivalente a 300 l/ha. Los estados fenológicos del cultivo durante el ensayo corres-pondieron a BBCH 62-68.

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Tabla 1: Tratamientos y aplicaciones.

Evaluaciones

Según las directrices planteadas en las guías EPPO de la serie ‘Efficacy evaluation of acaricides’ se siguió la metodología descrita en la guía PP1/037 (2) ‘Tetranychus urticae on vegetables’ para determinar el tipo, momento y frecuencia de las evaluaciones. En dicho documento se especifica respecto a estas variables:

  • Tipo de evaluación para judía enana: Evaluar un foliolo de la hoja trifoliada de cada una de las al menos 10 plantas marcadas previamente. Evaluando el número de huevos, ninfas y adultos de forma separada. Cabe decir que en este caso y dada la naturaleza de la sustancia a ensayar, efecto sobre individuos con capacidad de alimentarse, tan solo se evaluaron las poblaciones totales de formas móviles es decir, ninfas y adultos, sobre un total de 16 foliolos. Expresando la evolución de la población como el número de formas móviles medio por foliolo.
  • Momento y frecuencia de evaluación: Dada la naturaleza de la sustancia el objetivo es obtener unos datos que arrojen la mayor cantidad de información posible a cerca del comportamiento-respuesta de la plaga a las aplicaciones del producto. Las fechas de muestreo tras las diversas aplicaciones se escogieron para tener opción de evaluar aspectos como: el efecto de choque de la sustancia, la durabilidad del efecto del producto en el cultivo, el efecto acumulativo de diversas aplicaciones, etc. En todos los casos resulta imprescindible realizar una evaluación previa a las aplicaciones de producto. Las siguientes evaluaciones se pueden llevar a cabo a los 2-3, 7-10 días e incluso 14-21 días en función del modo de acción y efecto esperado que el producto evaluado vaya a tener.
  • Efectos directos sobre el cultivo: Así mismo, el cultivo debe ser examinado en busca de cualquier efecto fitotóxico que las plantas puedan manifestar.

Resultados y discusión

Como resultado de las 3 aplicaciones realizadas se observaron una serie de efectos claramente distinguibles. Aunque en ningún caso se consiguió “romper” el ciclo biológico de T. urticae, sí que se obtuvieron diferencias entre aplicaciones. En la tabla 2 se muestran los resultados numéricos y el análisis estadístico obtenido tras realizar el Análisis de la Varianza (ANOVA).

En todos los casos las sustancias aplicadas junto con el tensioactivo mostraron un mejor compor-tamiento que las mismas sustancias aplicadas solas. Es lógico suponer que esta respuesta sea debida a la mejor adhesión y distribución de gota que permite una adecuada cobertura foliar. Tanto es así que incluso en el caso del agua (T1: water y T2: water + EU) se obtienen diferencias numéricas llegando a ser en algunos casos significativas. Esto confirma la importancia que una formulación elaborada puede llegar a tener en la expresión de la sustancia activa del formulado.

Las figuras 1 y 2 muestran las gráficas de evolución de la severidad del ataque de araña roja y la eficacia obtenida por cada una de las tesis respecto al testigo no tratado.

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Tabla 2: Evolución poblacional de T. urticae por tratamiento.
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Figura 1 y 2: Gráficas de evolución de la población de araña roja (número de ninfas + adultos vivos/16 foliolos) para cada tratamiento.

El efecto debido al extracto proteico supuso una reducción del daño sobre las plantas que marcó la diferencia entre la viabilidad o no del cultivo durante el ensayo. En las fotografías puede observarse una muestra de las plantas tratadas con PhyCys y las no tratadas.
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Figura 3 y 4: A la izquierda conjunto de plantas tratadas con el extracto proteico de estudio (T6: PhyCys + EU) en comparación con las no tratadas (T7: UTC).

Conclusiones

  • El extracto crudo de proteínas PhyCys mostró un control entre moderado y bueno para el control de T. urticae. Con diferencias significativas frente al resto de tesis evaluadas.
  • Se consiguió un descenso significativo de la tasa de desarrollo del ácaro fitófago en aquellas plantas tratadas con el grupo proteico PhyCys.
  • Tan solo la adición de un tensioactivo (solución final sin formular) mejoró supuso una mejora en la eficacia del extracto estudiado de entre el 7 y el 15%.

Referencias bibliográficas

  • Ryan C.A. (1990). Proteinase inhibitors in plants: genes for improving defenses against insects and pathogens. Annual Review of Phytopatology 28: 425-449.
  • De Leo F., Volpicella M., Licciulli F., Liuni S., Gallerani R. y Ceci L.R. (2002). PLANT-PIs: a data-base for plant protease inhibitors and their genes. Nucleic Acids Research 30: 347-348.
  • Lawrence P.K. y Koundal K.R. (2002). Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects. Electronic Journal of Biotechnology 5: 93-109.
  • Martínez M., Díaz-Mendoza M., Carrillo L. y Díaz I. (2007). Carboxy terminal extended phytocysta-tins are bifunctional inhibitors of papain and legumain cysteine proteinases. FEBS letters 581: 2914-2918.

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