Favorece la detección de la enfermedad antes de la observación de síntomas en la planta

Captura y determinación molecular de esporas para la detección temprana de mildiu, oidio y botritis en viñedo

Díez-Navajas; A.M., Huerga, V.; y Ortiz-Barredo, A. (Neiker-Tecnalia. Departamento de Producción y Protección Vegetal)28/06/2013
Plasmopara viticola, Erysiphe necator y Botrytis cinerea, respectivamente, son los microorganismos que causan las enfermedades de mildiu, oidio y botritis de la vid. Son hongos que atacan las partes verdes de la planta, son muy comunes en viticultura y están ampliamente distribuidos a nivel mundial. Provocan grandes pérdidas económicas, debido a una disminución tanto de la calidad como de la cantidad del producto final de las cosechas. Las tres son tratadas cada campaña de forma repetitiva en muchos casos en base a un calendario preestablecido o del estado fenológico del cultivo.
Los tratamientos se realizan para su control mediante la prevención de su aparición, para retrasarla o minimizar su expresión debido sobretodo al carácter endémico que presentan, como es el caso del mildiu y del oidio. Esto significa que se repiten cada campaña, en zonas de cultivo concretas debido a las características ambientales que propician su instalación, evolución y desarrollo, aunque las condiciones habituales no hacen que aparezcan en zonas poco habituales a su desarrollo por un cambio de las mismas. Normalmente son detectadas visualmente por los síntomas que se presentan en la planta.

El mildiu es propio de regiones húmedas y templadas, y se manifiesta con manchas amarillentas de aspecto aceitoso por el haz, y con un césped blanco por el envés. Este césped es signo del oomiceto esporulado y fuente de inóculo para las sucesivas infecciones a lo largo de la campaña (Fig.1).

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Fig.1: Síntomas de mildiu en hoja. Manchas amarillentas de especto aceitoso por el haz (A), y con césped blanquecino por el envés, signo del oomiceto esporulado y fuente de inóculo para las sucesivas infecciones (B).
El oidio aparece con mayor asiduidad en condiciones de climas más secos y con una mayor oscilación de temperaturas, y se detecta en hoja por la presencia de pequeñas manchas verde claro en el haz de la hoja, y el polvillo ceniciento en los racimos. En estadios avanzados pueden observarse grietas en las bayas, llegándose a ver las pepitas de su interior (Fig. 2). La botritis aparece en condiciones de humedad relativa alta y temperaturas moderadas, afectando sobretodo al racimo. Se manifiesta mediante podredumbre del mismo, y es habitual ver un césped blanquecino sobre las bayas, signo evidente de la esporulación del hongo (Fig. 3).
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Fig. 2: Síntomas de oidio en hoja (A), y el polvillo ceniciento en los racimos, con grietas en las bayas, llegándose a ver las pepitas de su interior (B).
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Fig. 3: Síntomas de botritis en racimo. Podredumbre del mismo, y esporulación blanquecina sobre las bayas.
Los tres microorganismos que causan estas tres enfermedades se dispersan mediante esporas. Las esporas son pequeños corpúsculos por los que se reproducen, ocasionando nuevas infecciones mediante su instalación y desarrollo en tejido sano de la planta atacada.

La detección temprana de la enfermedad resulta altamente importante para su prevención, pues desde la instalación de las esporas sobre el tejido diana hasta la detección de los síntomas por el ojo humano pasan varios días. Durante este periodo de tiempo las esporas del patógeno se van esparciendo por la parcela, colonizando tejido sano y desarrollando así la enfermedad. Su pronta detección permite el control más localizado y evita la masiva dispersión posterior de la enfermedad por la posibilidad de aplicar un tratamiento de control antes de que la enfermedad sea visible.

En Neiker se ha desarrollado un método de detección simultánea de esporas de mildiu, oidio y botritis, basado en la captura pasiva de esporas y su identificación mediante la técnica de biología molecular de PCR Multiplex. Los dispositivos para la captura pasiva de esporas en campo constan de 4 trampas orientadas hacia los 4 puntos cardinales, y a 100 cm del suelo (Fig. 4). Las trampas consisten en portaobjetos impregnados de una sustancia adherente inerte, que son reemplazadas periódicamente.

La mencionada técnica molecular desplaza a la técnica de microscopía óptica bajo luz visible. Ésta consiste en la observación al microscopio previa tinción con lactofucsina ácida (0,1% lactofucsina ácida en ácido láctico). La técnica microscópica permite la diferenciación morfométrica de las esporas y la identificación de la especie fúngica. Pero resulta una técnica a menudo poco objetiva, ya que la morfología de algunas esporas puede ser confundida con otras similares, pueden ser enmascaradas por otras estructuras (polvo, polen) y se prolonga en el tiempo, pues consume más tiempo que las técnicas moleculares para la obtención de un resultado.
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Fig. 4: (A) Dispositivo con trampas para la captura de esporas a dos alturas. (B) Detalle de trampas orientadas hacia los cuatro puntos cardinales.
La PCR-Multiplex consiste en una reacción de amplificación de material genético para la identificación simultánea de las esporas de los tres microorganismos. Este método consiste en la amplificación de una secuencia de ADN (Ácido Desoxirribo Nucleico) de cada patógeno y que se encuentra en las esporas. Estas esporas llegan al laboratorio de diagnóstico pegadas en las trampas dispuestas en la viña para su captura, y como se ha descrito previamente.

Previamente a la amplificación de ADN, se requiere la extracción del mismo de las esporas que lo contienen, y que ésta sea lo más limpia posible para que no se produzcan interferencias en la amplificación para su posterior visualización en los geles de agarosa. Así, esta técnica incluye la eliminación mediante lavados específicos de posibles inhibidores de la reacción de amplificación que pueden estar presentes en las trampas de captura de esporas recogidas en campo (restos de suelo, restos de fungicidas, polen, esporas de otros hongos, etc.) y que supone el lavado de las mismas previo a la lisis de esporas y posterior obtención del ADN.

Tanto en el caso del microroganismo causante de mildiu (P. viticola) como del causante de oidio (E. necator), las bandas aparecen tras una primera reacción de amplificación. En cambio, para la identificación del microorganismo causante de botritis (B. cinerea) hace falta una segunda ronda de amplificación con el material obtenido en la primera reacción para conseguir visualizar la banda correspondiente a las esporas de este hongo (Fig. 5).

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Fig. 5: Bandas en gel de agarosa tras la amplificación del material genético procedente de esporas capturadas en trampas de impacto en campo. Calle 1: control negativo, indicador de ausencia de contaminación exógena. Calle 2: amplificación del material genético de esporas de los tres patógenos responsables del mildiu (208 pb) y oidio (367 pb). Calle 3: banda correspondiente a botritis (237 pb) tras la amplificación del producto obtenido en la primera PCR. Calle M: marcador de peso molecular.
Tras la puesta a punto de la reacción de amplificación, se testaron diferentes fungicidas utilizados y autorizados en el control de las tres enfermedades. Para ello se inocularon artificialmente las trampas con un número de esporas determinado y se testaron diferentes fungicidas autorizados y utilizados para el control de mildiu, oidio y botritis, e incluso insecticidas, acaricidas, fertilizantes y adyuvantes, como posibles inhibidores, a la misma dosis que la recomendada para su aplicación en el viñedo. Se utilizaron (Fig.6): 1: Oxicloruro de cobre 25% + Folpet 35% + Metalaxil 10%; 2: Oxicloruro de cobre 70%; 3: Copper 5%; 4: Sulfato pentahidratado de cobre; 5: Ciazofamida 2,3%; 6: Cimoxanil 4% + mancozeb 40%; 7: Folpet 37,5% + Iprovalicarb 6%; 8: Mandipropamid 5% + folpet 40%; 9: Mancozeb 64% + metalaxil-M 3,9%; 10: Pyraclostrobin 5%, metiram 55%; 11: Piraclostrobin 6,7%+dimetomorf 12%; 12: Fosetil-Al 50%+cimoxanil 4%+folpet 25%; 13: Mancozeb 80%; 14: Penconazol 20%; 15: Meptildinocap 35%; 16: Tetraconazol 12,5%; 17: Microbutanil; 18: Azufre micronizado 98,5%; 19: Azufre 80%; 20: Tebuconazol 25%; 21: Metiltiofanato 45%; 22: Mepanipirim 50%; 23: Pirimetanil 40%; 24: Fenhexamida 50%; 25: Ciprodinil 37,5%. fludioxonil 25%; 26: Ciprodinil 50%; 27: Dicofol 48%; 28: Flufenoxuron 10% p/v: 29: P2O5 12%. K2O 12%; 30: adyuvante no iónico 20%; 31: Peroxydisulfato amonio potasio 39%.
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Fig. 6: Resultados de las reacciones de amplificación de trampas inoculadas artificialmente con esporas de mildiu, oidio y botritis, y con fitosanitarios para el tratamiento y control de las tres enfermedades, susceptibles de inhibir la reacción de PCR. Se testaron diferentes fungicidas para el control de mildiu, oidio y botritis, e incluso insecticidas, acaricidas, fertilizantes y adyuvantes, como posibles inhibidores, a la misma dosis que la recomendada para su aplicación en el viñedo. Para cada caso: Calle a: reacción multiplex sin lavado de muestra. Calle b: reacción con lavado de las muestras previo a la extracción de ADN. La banda que amplifica a la altura de unos 200 pb se corresponde con P. viticola, y la que lo hace a unos 300 pb se corresponde con E. necator. Calle c: amplificación de B. cinerea a una altura de 200 pb tras una segunda ronda de amplificación. Calle (+): control positivo; Calle (-): control negativo.
Las trampas se lavaron mediante un protocolo que consta de varios lavados sucesivos con tampones de lavado de diferente composición, y posteriormente se procedió a la extracción del ADN para luego llevar a cabo la reacción Multiplex.

Los resultados mostraron detección de las bandas correspondientes a las esporas de los patógenos a detectar, mientras que tras la reacción de muestras sin lavado previo, la amplificación y consecuente detección resultaba aleatoria.

Así, el método descrito supone el primer método de PCR libre de inhibidores para la detección e identificación simultánea de esporas de P. viticola, E. necator y B. cinerea. Favorece la detección de la enfermedad antes de la observación de síntomas en la planta. Supone una herramienta para la toma de decisión de aplicación de tratamiento que favorece la reducción de las aplicaciones de fungicidas, así como a un avance en la protección del cultivo y del medio ambiente, pues podría disminuirse el número de estas aplicaciones al reducirse la presión de inóculo antes de su dispersión masiva por el viñedo.

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