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El estudio de la autocompatibilidad del almendro ha sido el objetivo principal de esta tesis, galardonada con el Premio Jóvenes Investigadores de la SECH

La autocompatibilidad en el almendro: estructura genética del alelo Sf y modificaciones de su expresión

El almendro, 'Prunus amygdalus' Batsch, es una especie diploide que pertenece al género Prunus. Aunque la autoincompatibilidad (AI) es un carácter importante en el reino vegetal desde el punto de vista evolutivo, la autocompatibilidad (AC) es un carácter agronómico muy crítico para asegurar la producción. De este modo, la AC se ha convertido en uno de los principales objetivos de los programas de mejora del almendro en todo el mundo. Aunque la AC ha sido identificada en algunas variedades de almendro, es muy poco frecuente (Socias i Company et al., 2010a). Los métodos utilizados para determinar la AC en el almendro han sido la observación de los tubos polínicos y el cuajado de frutos después de polinizaciones controladas.
Las nuevas técnicas moleculares se han ido aplicando cada vez más durante estas dos últimas décadas. De este modo, se ha conseguido determinar el genotipo de las variedades y selecciones de una manera muy rápida y eficaz. La AC se ha relacionado con la presencia del alelo 'Sf', el cual pertenece a la serie alélica 'S', y es dominante sobre los otros alelos de AI. Por ello siempre se había considerado que la AI/AC era un carácter cualitativo y no cuantitativo.
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Entre los individuos procedentes del cruzamiento de las variedades de almendro 'Vivot' x 'Blanquerna', sólo un 25% han sido AC, mientras que la proporción esperada era mucho mayor, un 50%. Un genotipado previo reveló que 'Vivot' poseía los haplotipos 'Sf' y 'S23' y 'Blanquerna' 'Sf ' y 'S8', por lo que las dos variedades deberían ser AC, aunque sus fenotipos mostraron ser diferentes. Esta diferencia fenotípica llevó a investigar los posibles distintos mecanismos de incompatibilidad que podrían intervenir en estas plantas. Las dos diferentes versiones del haplotipo 'Sf', una activa y AI ('Sfa') y la otra inactiva y AC ('Sfi'), han mostrado un mutuo reconocimiento, por lo que la Sfa-RNasa del estilo de ‘Vivot’ ha impedido el crecimiento del tubo polínico Sfi de ‘Blanquerna’ en una población de 80 individuos. Estos resultados sugieren la presencia de un locus modificador no ligado al locus 'S', el cual sería responsable del control de la AI/AC en esta población. Para ello se propuso un modelo de reconocimiento por el cual el locus modificador actúa de manera que concuerda con los fenotipos obtenidos en nuestra familia (Fernández i Martí et al., 2009a).

Aunque últimamente se ha profundizado mucho en el estudio del locus 'S' a nivel molecular (Hanada et al., 2009b), su mecanismo de acción sigue sin estar del todo establecido, por lo que se sugiere que otros genes externos son necesarios en la AI. Una vez propuesto que un locus modificador podría intervenir en el mecanismo de la AC en esta familia, durante esta tesis se ha pretendido localizarlo en el genoma del almendro. Para ello se ha realizado un ‘genome scan’ usando un centenar de marcadores microsatélites (SSR) distribuidos por los 8 cromosomas del genoma. Después de construir los mapas de ligamiento, se llevaron a cabo análisis de QTLs asociados a los fenotipos obtenidos y sorprendentemente se localizaron 2 QTL en nuestras selecciones. Estos resultados proponen la localización por primera vez en la familia de las rosáceas de dos nuevos loci situados fuera del locus 'S', y que se encuentran en los grupos 6 y 8 (Fig. 1). Ello permite sugerir que la AI es un carácter cuantitativo y no cualitativo, como se consideraba hasta la fecha (Fernández i Martí et al., 2011).

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Figura 1: Mapa de ligamiento de Vivot’ x ‘Blanquerna’, incluyendo la posición del locus 'S' y de los 2 nuevos loci identificados en G6 y G8.
Por otro lado, la construcción de una librería genómica (fósmido) en ‘Vivot’ y ‘Blanquerna’ ha permitido comprobar que tanto las secuencias de las Sf-RNasas como de los SFBf eran completamente idénticas, a pesar de producir dos expresiones fenotípicas tan distintas (Fernández i Martí et al., 2010b).

Como no ha sido posible encontrar ninguna mutación entre ambos Sf, a pesar de una gran cantidad de técnicas realizadas (NepHGE, Análisis de transcripción, Southern Blot, etc.) se ha sugerido la implicación de la metilación del ADN en esta población (Fernandez i Marti et al., 2012, submitted). La metilación puede producir cambios en los fenotipos o en la expresión de los genes sin alterar las secuencias del ADN. Los ensayos llevados a cabo en el transcurso de esta tesis usando el tratamiento de bisulfito para la conversión de las citosinas sugieren que el ADN metilado sería el responsable de la activación y/o inactivación del haplotipo 'Sf', ya que se ha encontrado un mutación de timina a citosina en la región ‘upstream’ de la RNasa.

De hecho, se ha podido comprobar que cuando la secuencia de la Sf-RNasa está metilada, ésta inactiva la expresión, por lo que esta inhibición se traduciría en una expresión AC, como es el caso de ‘Blanquerna’. En el caso contrario, si la secuencia de ADN no está metilada, como es el caso de ‘Vivot’, la RNasa permanece activa y a consecuencia la planta será AI. Este descubrimiento pone en evidencia que la epigenética ha influido de manera positiva en la evolución de las especies y que posiblemente, en su origen todas las variedades de las especies de 'Prunus' estarían en su forma incompatible, pero que con diferentes mutaciones, algunas de ellas silenciadas, unas se ha convertido en compatibles y otras no.

También se han querido abordar aspectos de modelización de proteínas a lo largo de este trabajo. Para ello se ha construido la estructura en 3D de las RNasas de los alelos 'Sf', 'S23' y 'S8' mediante herramientas bioinformáticas. La principal diferencia encontrada fue que en la estructura del 'Sf' había un lazo más largo que en las otras dos RNasas AI. En la bibliografía se ha descrito que los lazos grandes son susceptibles a la degradación proteolítica, por lo que este mismo fenómeno podría tener lugar en estas RNasas y tener una repercusión a nivel estructural y funcional entre alelos compatibles e incompatibles en almendro (Fernandez i Marti et al., 2012).

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Figura 2: Diagrama esteroscópico en 3D de la estructura modelizada de las RNasas 'S8', 'S23' y 'S8' del almendro, mostrando los elementos de la estructura secundaria (a). Representación superficial de la estructura modelizada de las mismas RNasas.
La construcción de una librería genómica (fósmido) en 'Vivot' y 'Blanquerna' ha permitido comprobar que tanto las secuencias de las Sf-RNasas como de los SFBf eran completamente idénticas
Por otro lado, en el transcurso de esta tesis doctoral y de modo complementario a los trabajos realizados para determinar la auto-compatibilidad, se han querido evaluar otros caracteres que empiezan a tener una gran importancia tanto para el programa de mejora del CITA como desde el punto de vista nutricional, y evidentemente de gran relevancia para el consumidor. Estos caracteres son los relacionados con la calidad de la almendra. Durante dos años se han evaluado en la misma población de 'Vivot' x 'Blanquerna' diversos componentes químicos, como los ácidos grasos (oleico, linoleico, palmítico, esteárico y palmitoleico), tocoferoles (α y β), proteínas o contenido total en aceite. Por otro lado se han evaluado de manera paralela otros caracteres físicos de la pepita y de la cáscara, como peso, anchura, diámetro geométrico, tamaño, etc. Para todos ellos, se ha determinado por primera vez en almendro su control genético, encontrando alrededor de 25 QTLs con unos porcentajes de explicación superiores al 75% en la mayoría de los casos y cubriendo prácticamente todo el genoma del almendro (Fernandez i Marti et al., 2012; Font i Forcada et al., 2012).
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Figura 3: Mapa de ligamiento de 'Vivot' x 'Blanquerna', incluyendo la posición de los QTL asociados a la calidad del fruto.
Por último, se examinó molecularmente el material vegetal del banco de germoplasma del almendro ubicado en el CITA de Aragón, el cual es el de referencia de la FAO y el INIA, siendo uno de los más importantes a nivel mundial (Fernandez i Marti et al., 2009c).

Esta tesis ha sido multidisciplinar, en la cual se han trabajado con caracteres tan importantes desde el punto de vista agronómico como nutricional (compatibilidad, ácidos grasos, tocoferoles, etc). Todos estos resultados obtenidos están directamente relacionados con los objetivos del proyecto de Mejora Genética del Almendro que se viene desarrollando en el CITA de Aragón y del que han derivado las variedades de almendro de mayor éxito actualmente en el cultivo del almendro en España y van a ser servir para incrementar la eficacia de esta línea de investigación.

Referencias bibliográficas

- Fernández i Martí A, Hanada, T., Alonso, J.M., Yamane, H., Tao, R., Socias i Company R., 2009a. A modifier locus affecting the expression of the S-RNase gene could be the cause of breakdown of self-incompatibility in almond. Sex. Plant Reprod. 22: 179-186.

- Fernández i Martí, A., Alonso, J.M., Espiau, M.T., Rubio-Cabetas, M.J., Socias i Company, R. 2009b. Genetic diversity in Spanish and foreign almond germplasm assessed by molecular characterization with SSRs. J. Amer. Soc. Hortic. Sci. 134: 535-542.

- Hanada, T., Fukuta, K., Yamane, H., Esumi, T., Gradziel, T.M., Dandekar, A.M., Fernández i Martí, A., Alonso, J.M., Socias i Company, R., Tao, R., 2009. Cloning and characterization of self-compatible Sf haplotype in almond (Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb.). HortScience 44, 609-613.

- Fernández i Martí A, Hanada, T., Alonso, J.M., Yamane, H., Tao, R., Socias i Company R., 2010. The almond Sf haplotype shows a double expression despite its comprehensive genetic identity. Scientia Hortic. 125: 685-691.

- Socias i Company, R., Fernández i Martí, À., Kodad, O., Alonso, J.M., 2010. Self-compatibility evaluation in almond: strategies, achievements and failures. HortScience. 45, 1-5.

- Fernandez i Marti A., Howad, W., Tao, R., Alonso, J.M., Arús, P and Socias i Company, R. 2011. Identification of QTL associated with self-compatibility in Prunus. Tree Genet. Genomes 7: 629-639.

- Fernández i Martí A, Wirthensohn M, Alonso JM, Socias i Company R, Hrmova M. 2012a. Molecular modeling of S-RNases involved in almond self-incompatibility. Frontiers in Plant Science (doi: 10.3389/fpls.2012.00139).

- Fernández i Martí A, Font i Forcada C, Socias i Company R. 2012b. Genetic analysis for physical nut traits in almond (2012). Tree Genet. genomes (doi: 10.1007/s11295-012-0566-8).

- Fernández i Marti A, Akagi T, Hanada T, Tao R and Socias i Company R. 2012c. Self-compatibility in Prunus species could be linked to DNA methylation. (submitted).

- Font i Forcada C, Fernández i Martí A, Socias i Company R. 2012. Mapping QTLs for kernel composition in almond. BMC Genetics 13:47.

- Socias i Company R, Kodad O, Fernández i Martí A, Alonso JM. 2012. Pollen tube growth and self-compatibility in almond. Plants (doi:10.3390/plants10x000x).

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