Influencia de la edad y el tipo de diluyente sobre la viabilidad del semen refrigerado

En la refrigeración seminal, la mayor parte de los diluyentes, utilizan yema de huevo sin procesar y muy pocos estudios han valorado la utilización de yema de huevo clarificada para la preservación del semen en el macho cabrío (Tabarez et al., 2017; Swelum et al., 2018). La utilización de yema de huevos de diferentes especies aviares (y su procesado), pueden generar modificiaciones en sus componentes (ácidos grasos, fosfolípidos, LDL y oligoelementos), y por tanto, su efecto sobre las membranas de los espermatozoides y la calidad espermática final.

Animales

Se utilizaron siete machos sanos de la raza Majorera como donantes de semen. Se definieron dos grupos: machos adultos (n = 3, edad: 3-5,5 años y peso entre 55 y 70 kg) y machos jóvenes (n = 4, edad 11-12 meses y peso entre 35 y 40 kg). Cada grupo fue alojado en un corral colectivo (alrededor de 60 m2) y alimentado con una mezcla de maíz, soja y alfalfa deshidratada; las sales minerales y el agua se proporcionaron ad libitum. El estudio se llevó a cabo en la granja experimental de la Facultad de Veterinaria de Las Palmas (Islas Canarias, España, España) entre febrero y mayo de 2020. Todo el trabajo experimental se llevó a cabo de acuerdo con las leyes europeas de bienestar animal y experimentación.

Diseño experimental

Los eyaculados (n = 42) de los siete machos fueron recogidos, evaluados y procesados individualmente, y las muestras de semen se dividieron en dos alícuotas. La primera alícuota se diluyó en el primer diluyente (EY, Tris-glucosa, yema de huevo al 12%) para alcanzar una concentración final de 200 x 106 espermatozoides/ml; la segunda alícuota se diluyó con un segundo diluyente (CEY, Tris-glucosa, yema de huevo clarificada al 12%). Ambas alícuotas se mantuvieron a 4°C durante diferentes períodos de tiempo (1, 24, 48, 72 y 96 horas); después del período de refrigeración se evaluó la calidad del semen (motilidad espermática, porcentajes de espermatozoides anormales, espermatozoides vivos y acrosomas dañados).

Recogida y contrastación del semen

De cada macho se recogió semen, una vez a la semana durante 6 semanas consecutivas, utilizando una vagina artificial. En los machos jóvenes, fue necesario un período de entrenamiento antes del inicio del trabajo experimental para conseguir una recogida adecuada. Inmediatamente después de la recogida, los eyaculados se colocaron en un baño de agua (37°C) y se tomaron alícuotas para evaluar la calidad del semen.

Todas las muestras de semen se evaluaron para determinar el volumen, la concentración de espermatozoides y los porcentajes de espermatozoides móviles, la viabilidad de los espermatozoides, la morfología anormal y los espermatozoides con integridad del acrosoma. El volumen de semen se definió directamente mediante examen visual en un tubo calibrado. La concentración de espermatozoides se determinó mediante un espectrofotómetro Spermacue® (Minutübe GmbH, Alemania). La proporción de espermatozoides móviles se evaluó subjetivamente, se colocó una gota de semen diluido sobre un portaobjetos y se definió el porcentaje de espermatozoides móviles en, al menos, diez campos diferentes utilizando un microscopio de contraste de fase con un aumento de 200X. Los porcentajes de espermatozoides con espermatozoides anormales (cabeza, pieza intermedia y cola) y acrosomas anormales se estimaron con la técnica de tinción Spermac® (Minitübe. Tiefenbach, Alemania) utilizando un microscopio de contraste de fase a 1000X de aumento, examinando un mínimo de 200 espermatozoides. células por portaobjetos. La viabilidad de los espermatozoides se definió utilizando la tinción vital eosina-nigrosina, utilizando un microscopio de contraste de fase. con un aumento de 400X.

Procesado y refrigeración de las muestras seminales

El procesado de semen de machos se realizó como se describe en Batista et al. (2014). Brevemente, los eyaculados se diluyeron en solución de lavado (Tris 250 mM, glucosa 28 mM, ácido cítrico 104 mM) a 37°C y se centrifugaron dos veces a 700 x g, durante 15 min (temperatura ambiente, 20-22°C). En este momento, el pellet resultante se dividió en dos alícuotas; la primera alícuota se diluyó en un diluyente EY (Tris 250 mM, glucosa 28 mM, ácido cítrico 104 mM, yema de huevo al 12%, estreptomicina al 0.05%, penicilina 500 UI / mL y agua destilada a 100 ml) para alcanzar una concentración final de 800 x 106 espermatozoides/ mL. El segundo diluyente (CEY) se diluyó en un diluyente similar al primero, pero que incluía yema de huevo clarificada (Tris 250 mM, glucosa 28 mM, ácido cítrico 104 mM, yema de huevo clarificada al 12%, estreptomicina al 0.05%, penicilina 500 UI / mL y agua destilada hasta 100 ml). La yema de huevo clarificada se obtuvo mezclando volumen similar de yema de huevo y solución salina y se centrifugó a 10000g, durante 30 minutos, a 4°C; luego se obtuvo el sobrenadante en forma de yema de huevo clarificada.

Antes de enfriar, se evaluó nuevamente la motilidad de los espermatozoides y el semen diluido se dividió en 4 alícuotas. Las cinco alícuotas se enfriaron a 4°C durante diferentes períodos de tiempo: R24, el semen se enfrió durante 24 horas; R48, el semen se enfrió durante 48 horas; R72, el semen se enfrió durante 72 horas y R96, el semen se enfrió durante 96 horas. Después de cada período de refrigeración, se evaluó la motilidad de los espermatozoides (total y progresiva) de cada alícuota, espermatozoides vivos/muertos, y espermatozoides con acrosoma intacto, utilizando técnicas similares a las descritas anteriormente.

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como media ± DE. Los datos se sometieron a análisis de varianza (ANOVA) utilizando el procedimiento de modelo lineal general de SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). El modelo lineal incluyó los efectos de la edad (adultos y jóvenes), los diluyentes de semen (dos protocolos) y el tiempo de conservación (24, 48, 72, 96 h). Las diferencias entre medias se analizaron mediante la prueba de Duncan. Los valores se consideraron estadísticamente significativos cuando P < 0,05.

Del mismo modo, en animales jóvenes, los valores medios de espermatozoides vivos se mantuvieron uniformes durante todo el período experimental, también sin observar la influencia del tipo de diluyente. Finalmente, al comparar machos adultos y jóvenes no se detectaron diferencias significativas entre ambos grupos, con valores similares, en las muestras conservadas en el mismo diluyente.

Figura 3. Viabilidad espermática en machos adultos durante el periodo de refrigeración.

Las características del semen en fresco en machos adultos fueron comparables a las descritas previamente en la misma raza (Batista et al., 2014) y en otras razas caprinas (Leboeuf et al., 2000). El semen se obtuvo al comienzo de la temporada de reproducción, y esto puede explicar la alta calidad del semen fresco. Diferentes estudios han confirmado la influencia del fotoperíodo sobre las características seminales, especialmente en lo que respecta a la concentración de espermatozoides (Coloma et al., 2010). Con respecto a los machos jóvenes, las únicas diferencias observadas en la calidad del semen fresco se relacionaron con el volumen eyaculado y la concentración total; estos hallazgos son completamente consistentes con el tamaño testicular y el peso corporal, ya que ambas características están estrechamente relacionadas con la producción seminal (Fuerst-Waltl et al., 2006; Furstoss et al., 2009; Arangasamy et al., 2018). Los demás parámetros medidos no mostraron diferencias estadísticamente significativas, lo que indica que los machos Majorera alcanzan una madurez suficiente alrededor de los 12 meses de edad. Finalmente, se observaron diferencias individuales entre individuos tanto en machos jóvenes como adultos, indicando que estas diferencias individuales ya están definidas desde que los machos alcanzan la madurez sexual (Morales et al., 2006).

En cuanto a la motilidad progresiva, este estudio muestra que no existen diferencias significativas entre machos jóvenes y adultos, ni con el uso de EY o CEY, registrando un ligero descenso conforma avanza el periodo de refrigeración. A pesar que ambos diluyentes mostraron una similar eficacia para la conservación del semen, el diluyente basado en CEY presentaba siempre mejores resultados, circunstancia que puede explicarse por el menor número de partículas existentes en CEY, ya que mediante centrifugación se eliminan las partículas que pueden representar un obstáculo en el movimiento progresivo de los espermatozoides. Respecto a la viabilidad espermática, tampoco se detectaron diferencias significativas entre machos jóvenes y adultos, ni en base al tipo de diluyente empleado. La motilidad y la viabilidad espermática son parámetros estrechamente relacionados y habitualmente son los mejores indicadores de la posterior fertilidad del semen. Nuestros resultados fueron comparables a los observados por Tabarez et al. (2017), que comparó el efecto de la yema de huevo y la edad del macho cabrío sobre la criopreservación de espermatozoides de macho cabrío, confirmando que la calidad seminal post-descongelación no mostró diferencias significativas en la motilidad y vitalidad espermática.

El choque térmico no solo afecta la movilidad y viabilidad de los espermatozoides, sino también la membrana acrosómica y la morfología del esperma. La membrana del acrosoma de los espermatozoides es muy sensible a los cambios de temperatura, por lo que parece lógico que su integridad disminuya a medida que el tiempo de enfriamiento se alarga, como se ha observado en el presente trabajo. Varios mecanismos se encuentran detrás de estas reducciones (cambios osmóticos, daño acrosómico, condensación de cromatina), tal como se han descrito en numerosos estudios (Batista et al., 2011; Batista et al., 2014; Bashawat et al., 2021). De manera simialar a lo observado en la motilidad y viabilidad espermática, el porcentaje de acrosomas anormales no mostró diferencias entre ambos tipos de diluyentes, ni entre grupos de animales por la edad y se detectó una disminución (en comparación con los valores en fresco), a partir de las 72 horas de preservación.

El presente estudio confirmó que los diluyentes utilizados mostraron la misma eficacia para la preservación del semen. Asimismo, la calidad seminal apenas se modificó durante las primeras 48 horas de conservación y a partir de ese momento, manifestó un ligero pero progresivo descenso. No obstante, se puede asumir que ambos diluyentes permiten mantener niveles óptimos (hasta 96 horas), de tal forma que su capacidad fertilizante podría mantenerse durante todo el periodo evaluado. Este hallazgo, puede ser de utilidad en aquellas áreas geográficas donde sea preciso realizar inseminaciones en explotaciones ganaderas, alejadas entre sí o como en el caso de las Islas Canarias, sea preciso el transporte por mar de muestras seminales, Por otro lado, la edad de los machos cabríos no mostró ser un factor determinante sobre la preservación seminal, de tal manera que, una vez los machos cabríos alcanzan la madurez sexual (12 meses), el semen puede preservarse con similares características a los registradas en machos adultos.

Referencias bibliográficas

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