Evaluación de nuevas vacunas frente a la tuberculosis en caprino

Recientemente se defendió en la Universidad Complutense de Madrid la tesis titulada ‘Evaluación de nuevas vacunas frente a la tuberculosis en ganado caprino y avances en su diagnóstico inmunológico’, la cual ahondaba en dos estrategias de control de la tuberculosis en ganado caprino, diagnóstico y vacunación. Estas dos estrategias se abordaron en los dos principales objetivos de la tesis, por un lado, detectar posibles puntos de mejora y optimizar el rendimiento diagnóstico de las técnicas inmunológicas empleadas en el ganado caprino, y por otro, evaluar la eficacia e inmunogenicidad de nuevas vacunas frente a la tuberculosis y el efecto de la suplementación con vitamina D en ganado caprino usando un modelo de infección natural.

La tuberculosis en ganado caprino es una micobacteriosis zoonósica, principalmente causada por M. caprae y M. bovis, que produce importantes pérdidas económicas en el sector caprino y supone un reservorio de la enfermedad para otras especies domésticas y silvestres. El diagnóstico activo de la enfermedad en ganado caprino solo se realiza en aquellos países que tienen implantados programas de erradicación de tuberculosis en ganado bovino, en concreto, en aquellas explotaciones de ganado caprino que conviven o tienen algún nexo con ganado bovino infectado. En España, sin embargo, se han implantado programas de erradicación específicos en ganado caprino en algunas Comunidades Autónomas con censos importantes. Estos programas se basan principalmente en el uso de la intradermotuberculinización (IDTB), y puntualmente en el uso de la prueba de detección de IFN-γ (IGRA) en explotaciones infectadas. Además, existen algunas técnicas serológicas de detección de anticuerpos comercializadas y otras en fase experimental.

La información notificada en los distintos estudios revisados presentó algunas carencias en algunos campos que pueden ser determinantes en el rendimiento de la prueba (por ejemplo, en el caso de la IDTB, la potencia de la tuberculina, el fabricante o la zona de inoculación). En nuestro estudio, la sensibilidad estimada de la IDTB simple (51% y 59%, dependiendo del criterio de interpretación) y comparada (30% y 50%, dependiendo del criterio de interpretación) fue inferior a la descrita en la bibliografía en el ganado bovino, aunque la especificidad fue elevada en ambos casos (igual o superior a 95%). Sin embargo, la especificidad estimada de la IDTB simple se vio comprometida en ensayos que notificaron la vacunación frente a M. avium subsp. paratuberculosis (MAP) (78% y 90% dependiendo del criterio de interpretación). Por otra parte, la sensibilidad del IGRA fue ligeramente superior a la IDTB (66% y 72%, dependiendo del punto de corte), manteniendo una buena especificidad (entre 98% y 99%). Desgraciadamente, la elevada heterogeneidad hallada entre estudios en el cálculo de la mayoría de las estimaciones agrupadas de sensibilidad y especificidad de las técnicas impidió obtener unos resultados concluyentes. No obstante, estos resultados preliminares indicarían la recomendación de emplear varias pruebas en paralelo en explotaciones infectadas para aumentar la sensibilidad diagnóstica. También ponen de manifiesto la necesidad de más estudios de optimización de las técnicas diagnósticas en ganado caprino, con especial interés en la evaluación de las técnicas serológicas por su buen coste-beneficio.

El segundo estudio (2) de la tesis se realizó con objeto de evaluar la interferencia observada por la vacunación frente a MAP en las técnicas diagnósticas de tuberculosis empleadas en ganado caprino, principalmente en la IDTB simple. Concretamente, la finalidad del estudio fue evaluar la tendencia temporal de la interferencia causada por la vacunación frente a MAP en la IDTB, IGRA y dos técnicas serológicas de detección de anticuerpos (ELISA P22 y DR-ELISA). En este sentido, en una cohorte de 99 cabras vacunadas frente a MAP a los siete meses de edad de una explotación sin antecedentes previos de tuberculosis, la vacunación produjo un porcentaje variable y decreciente de reactores en la IDTB simple hasta los 12 meses tras la vacunación, momento en el que no se observaron reactores positivos. La IDTB comparada y el IGRA demostraron ser técnicas muy específicas independientemente del tiempo posvacunación, y la especificidad de las técnicas serológicas disminuyó progresivamente por la realización de repetidas IDTB en intervalos de tres meses tras la vacunación.

En el último estudio de este primer apartado de diagnóstico (3) se evaluó la utilidad de las muestras de leche para la detección de anticuerpos frente a tuberculosis empleando un ELISA experimental (ELISA P22). Para ello, se recogieron muestras de suero y leche de dos explotaciones de ganado caprino con distinta prevalencia, una de alta prevalencia aparente (72,2%) y otra de baja prevalencia aparente (7,3%) a las pruebas de base celular (IDTB e IGRA). Las muestras de leche recogidas para el estudio procedieron de los animales en lactación de cada explotación. La correlación entre los títulos de anticuerpos de muestras de leche y suero fue muy fuerte en la explotación de alta prevalencia (r_s = 0,91) y moderada en la de baja prevalencia (r_s = 0,46). En lo relativo a los resultados preliminares del rendimiento diagnóstico en un grupo de animales sacrificados de manera aleatoria al final del estudio, el ELISA P22 usando muestras de suero o leche fue la técnica diagnóstica que detectó el porcentaje más alto de animales que presentaron lesiones compatibles y/o cultivo positivo. En este estudio también se pudo concluir que la conservación de las muestras de leche refrigeradas en azidiol durante una semana no afectó al resultado cualitativo ni cuantitativo de la prueba. Estos resultados preliminares indican que el uso en paralelo de la IDTB y el ELISA P22 en explotaciones infectadas, ya sea empleando muestras de suero o leche, puede suponer una herramienta diagnóstica eficiente y económicamente viable para maximizar la detección de animales infectados y acelerar el control de los brotes. Por otra parte, aunque todavía son necesarios más estudios en distintas explotaciones con diferente prevalencia y número de animales en lactación, las muestras de tanque de leche podrían suponer una opción de cribado a nivel de explotación en regiones donde no se aplican programas de erradicación o no es viable la realización de un diagnóstico individual.

La vacunación frente a tuberculosis podría constituir una herramienta de control de gran utilidad aunque requeriría el desarrollo de estrategias DIVA (differentiating infected from vaccinated animals por sus siglas en inglés) específicos para distinguir infectados de vacunados en el caso de combinarse con técnicas de diagnóstico. El ganado caprino es un modelo animal versátil para el desarrollo de vacunas frente a la tuberculosis, por un lado, empleado para la evaluación de vacunas destinadas a esta y otras especies domésticas y silvestres, y por otro, como modelo preclínico de vacunas destinadas a humanos. Este segundo bloque de vacunación comprendió cuatro estudios relativos a la evaluación de nuevas vacunas frente a la tuberculosis y el efecto preventivo o terapéutico de la suplementación con vitamina D en ganado caprino expuesto a una infección natural.

En los dos primeros trabajos de investigación se estudió la inmunogenicidad y eficacia de la vacuna M. bovis inactivada por calor HIMB en ganado caprino. En el primer estudio de este apartado de vacunación (4), HIMB se administró por vía intramuscular y oral empleando un protocolo de vacunación-revacunación. El grupo vacunado por vía oral no presentó ningún reactor positivo en la IDTB, en el IGRA ni en un ELISA experimental basado en PPD bovina a los dos meses de la administración de la segunda dosis. Sin embargo, se observó interferencia en la mayoría de los animales del grupo vacunado por vía intramuscular en la IDTB simple y en el IGRA (68,8% y 62,5%, respectivamente).

En otro estudio (5) también se evaluó la eficacia de esta vía de administración, en el que la vacunación con HIMB por vía intramuscular confirió una protección parcial frente a una infección natural de M. caprae, concretamente reduciendo el número de lóbulos pulmonares craneales con lesiones en los animales vacunados con respecto al grupo control tras una exposición natural de diez meses de duración. Sin embargo, la reducción global en términos de gravedad de las lesiones no fue significativa.

Los dos últimos estudios de este apartado de vacunación e inmunomodulación incluyeron la evaluación de la eficacia de las vacunas BCG y MTBVAC y de la suplementación con vitamina D en ganado caprino empleando el mismo sistema de infección natural del quinto estudio. Los resultados de estos dos estudios tienen aplicación en dos vertientes, la primera es la utilidad directa de MTBVAC y la suplementación con vitamina D en ganado caprino u otros hospedadores animales relacionados, y la segunda está enfocada a aportar nuevos datos preclínicos empleando un modelo experimental de cabra frente a una infección natural de M. caprae. MTBVAC es una vacuna M. tuberculosis atenuada mediante la deleción de los genes genes phoP y fadD26 que se postula como candidata para sustituir a la BCG en neonatos o como refuerzo de esta en adolescentes, y que actualmente se encuentra en fase clínica.

En este sentido, el tercer estudio de vacunación (6) consistió en la evaluación de la inmunogenicidad y eficacia de las vacunas BCG y MTBVAC. Para la consecución de tales objetivos se empleó un modelo de transmisión natural en el que los dos grupos vacunales y otro control fueron expuestos a un grupo de animales infectados con M. caprae durante nueve meses (Figura 2). En lo que respecta a los resultados de inmunogenicidad, MTBVAC presentó una mayor respuesta de IFN-γ tras la estimulación con PPD bovina en el IGRA y un mayor número de animales positivos en comparación con el grupo BCG al mes posvacunación, si bien también se observó cierta reactividad cuando se emplearon los antígenos ESAT-6 y CFP-10. Esta aparentemente mayor inmunogenicidad en el IGRA no se correlacionó con protección y pone de manifiesto la necesidad de buscar nuevos antígenos DIVA específicos para distinguir infectados de vacunados con MTBVAC. En lo relativo al grado y extensión de las lesiones post mortem observadas, estos parámetros fueron menores en los linfonodos pulmonares y en el total de los órganos examinados en los grupos MTBVAC y BCG, en los pulmones en el grupo BCG y en el número de animales con lesiones extrapulmonares en el grupo MTBVAC con respecto al grupo control, no encontrándose diferencias entre ambos grupos vacunales.

Por último, algunos autores han estudiado la suplementación con vitamina D, dentro de las llamadas terapias dirigidas al hospedador en humanos (host-directed therapies o HTDs), como terapia complementaria al tratamiento antibiótico para mejorar el resultado clínico o acortar el tratamiento por un lado, y por otro lado, como estrategia preventiva para potenciar el sistema inmune y prevenir el desarrollo de la enfermedad. No obstante, apenas hay estudios del efecto inmunomodulador de la vitamina D en animales domésticos y únicamente un estudio previo en ciervos y jabalíes ha evaluado el efecto que tiene la suplementación con vitamina D en la prevención y el desarrollo de lesiones de tuberculosis.

En el último estudio de la tesis (7) se evaluó el efecto profiláctico y/o terapéutico de la suplementación con vitamina D en ganado caprino expuesto a una infección natural de M. caprae durante diez meses. En este estudio, la suplementación con vitamina D₃ no tuvo ningún efecto en la supresión de la respuesta de tipo Th1 en términos de niveles de IFN-γ detectados en el IGRA tras la estimulación con PPD bovina, detectándose incluso reactores al IGRA y la IDTB con anterioridad en el grupo suplementado. En lo que respecta a la eficacia, nuestros resultados indicaron que la suplementación con dosis elevadas de vitamina D₃ cada dos meses no redujo ni el riesgo de infección ni el número de animales con lesiones o aislamientos de M. caprae, ni la gravedad ni en el número de lesiones observadas por animal. Por el contrario, el grupo suplementado presentó hiperfosfatemia y daño renal con calcificaciones asociadas a una intoxicación con vitamina D.

Conclusiones

Los resultados obtenidos en la tesis sobre el rendimiento de distintas técnicas inmunológicas de diagnóstico de tuberculosis en ganado caprino pueden contribuir a una mayor optimización en la aplicación de las mismas y a la mejora del diseño de los programas erradicación. Asimismo, los estudios de eficacia de las distintas vacunas evaluadas empleando infecciones naturales podrían favorecer el desarrollo e implementación de estas vacunas para el control de la tuberculosis animal y humana.

Agradecimientos

La realización de esta tesis doctoral ha sido posible gracias a una beca predoctoral de ayudas para contratos para la formación de investigadores en empresas 2015 (Doctorados Industriales, DI-15-08110, entidad CZ Vaccines), financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, la Agencia Estatal de Investigación y Fondos Estructurales de la Unión Europea (FSE). En el desarrollo de esta tesis también han contribuido el Centro de Vigilancia Sanitaria (VISAVET) de la Universidad Complutense de Madrid, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA), la Consejería de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural de la Junta de Castilla y León, el Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos (IREC), el Instituto Vasco de investigaciones agrarias (NEIKER), Maeva Servet S.L, la Universidad de Zaragoza, la Universidad de Córdoba y el Instituto de Salud Carlos III.

Bibliografía

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2. Roy A., Infantes-Lorenzo J.A., Blázquez J.C., Venteo A., Mayoral F.J., Domínguez M., Moreno I., Romero B., de Juan L., Grau A., Domínguez L., Bezos J., 2018. Temporal analysis of the interference caused by paratuberculosis vaccination on the tuberculosis diagnostic tests in goats. Preventive Veterinary Medicine 156, 68-75. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2018.05.010.
3. Roy A., Infantes-Lorenzo J.A., Domínguez M., Moreno I., Pérez M., García N., García-Seco T., Álvarez J., Romero B., Gortázar C., de Juan L., Domínguez L., Bezos J., 2020. Evaluation of a new enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of tuberculosis in goat milk. Research in Veterinary Science 128, 217-223. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2019.12.009.
4. Roy A., Risalde MA., Casal C., Romero B., de Juan L., Menshawy A.M., Díez-Guerrier A., Juste R.A., Garrido J.M., Sevilla J.A., Gortázar C., Domínguez L., Bezos J., 2017. Oral vaccination with heat inactivated Mycobacterium bovis does not interfere with the antemortem diagnostic techniques for tuberculosis in goats. Frontiers in Veterinary Science 4, 124. https://doi.org/10.3389/fvets.2017.00124.
5. Roy A., Risalde M.A., Bezos J., Casal C., Romero B., Sevilla I.A., Díez-Guerrier A., Rodríguez-Bertos A., Domínguez M., Garrido J.M., Gortázar C., Domínguez L., 2018. Response of goats to intramuscular vaccination with heat-killed Mycobacterium bovis and natural challenge. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 60, 28-34. https://doi.org/10.1016/j.cimid.2018.09.006.
6. Roy A., Tomé I., Romero B., Lorente-Leal V., Infantes-Lorenzo J.A., Domínguez M., Martín C., Aguiló N., Puentes E., Rodríguez E., de Juan L., Risalde M.A., Gortázar C., Domínguez L., Bezos J., 2019. Evaluation of the immunogenicity and efficacy of BCG and MTBVAC vaccines using a natural transmission model of tuberculosis. Veterinary Research 50, 82. https://doi.org/10.1186/s13567-019-0702-7.
7. Risalde MA., Roy A., Bezos J., Pineda C., Casal C., Díez-Guerrier A., López-Villalba I., Fernández-Manzano A., Moreno I., de Juan L., Domínguez L., Gortázar C., 2019. Hypervitaminosis D has no positive effects on goat tuberculosis and may cause chronic renal lesions. The Veterinary Record 185, 759. https://doi.org10.1136/vr.105411.