Avances en el programa de mejora de olivo para la resistencia a la Verticilosis: el uso de la biotecnología

Entre las diferentes líneas de investigación que desarrolla el programa de mejora de olivo del Instituto Andaluz de Investigación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA), se desarrolla la línea de búsqueda de resistencia a la Verticilosis del olivo. Desde que fue incorporada, ha permitido la evaluación del nivel de resistencia a la enfermedad de alto número de genotipos de diferente procedencia génica. Ello ha permitido seleccionar algunos de los genotipos como resistentes a la enfermedad al estudiar diferentes variables de desarrollo de síntomas de enfermedad y de colonización. Además de la continuidad del estudio de estos genotipos en las etapas avanzadas del programa de mejora, la aplicación de biotecnología se introduce como herramienta para incrementar el conocimiento en la interacción olivo/Verticillium dahliae.

El cultivo del olivo (Olea europea L.) se distribuye a nivel mundial en más de once millones de hectáreas plantadas que se distribuyen no sólo en países de la cuenca Mediterránea como España, Italia o Grecia, también emerge en nuevos países sin previa tradición olivarera que incorporan el olivo a su agricultura como son Argentina, China o Chile. En ellos, la principal amenaza fitosanitaria descrita es el mundialmente distribuido hongo del suelo Verticillium dahliae Kleb., causante de la Verticilosis del olivo.

La Verticilosis del olivo se desarrolla en campo en base a dos síndromes denominados apoplejía y decaimiento lento descritos en España por Blanco-López et al. (1984). La apoplejía se muestra principalmente entre invierno y primavera afectando de forma rápida a hojas, brotes y ramas con necrosis. Las hojas pueden abarquillarse y, generalmente, se secan manteniéndose en las ramas. Es un síndrome que con frecuencia provoca la muerte del árbol. El decaimiento lento normalmente tiene más impacto en la primavera y principio de verano, caracterizándose por la defoliación parcial de las ramas afectadas, y/o la necrosis de inflorescencias y frutos.

A nivel fitopatológico, las poblaciones de V. dahliae obtenidas de plantas de algodonero y olivo en España se han caracterizado a nivel genético y molecular, en dos grandes grupos o patotipos denominados Defoliante (D) y No Defoliante (ND) (Rodríguez-Jurado et al. 1993; López-Escudero and Mercado-Blanco, 2011; Jiménez-Díaz et al. 2012). En la figura 1 pueden verse reacción sintomática de la enfermedad a ambos patotipos citados.

Figura 1: Sintomatología causado por patotipo Defoliante y No Defoliante de V. dahliae.

La sintomatología descrita puede ser similar a la provocada por otras amenazas del cultivo como la bacteria Xylella fastidiosa, que en la actualidad está causando altas pérdidas de plantas de olivo en el sur de Italia (Saponari et al. 2013); enfermedades causadas por otros hongos de suelo como Phytophthora spp. o por alteraciones climáticas o nutricionales, entre otros. Por tanto, el diagnóstico de la enfermedad resulta clave para el correcto manejo de la misma.

El control de la Verticilosis del olivo es complicado por lo que se recomienda un manejo integral incluyendo diferentes medidas preventivas y/o paliativas. La amplia dispersión y la virulencia del patotipo Defoliante sumadas a la naturaleza vascular de la Verticilosis en un cultivo perenne han dificultado el control de la enfermedad. Hoy en día no existe fungicida disponible como medida de control de la Verticilosis del olivo, por lo que la resistencia varietal es una medida de control de la enfermedad reconocida por ser complementaria a otras medidas de control, económica y respetuosa con el medio ambiente. Sin embargo, un número muy reducido de variedades muestran resistencia al desarrollo de síntomas ante la infección. Por ello, una nueva línea de trabajo se incorporó al programa de mejora de olivo del centro IFAPA Alameda del Obispo de Córdoba, con el objetivo de obtener nuevas variedades que combinen buenas características agronómicas y altos niveles de resistencia al desarrollo de síntomas de la Verticilosis. El desarrollo de técnicas de Biotecnología y su aplicación en la interacción olivo/V. dahliae, persigue una aumento del conocimiento de la enfermedad y un desarrollo futuro de herramientas moleculares de ayuda en la selección a la enfermedad en el programa de mejora de olivo.

El objetivo general de este programa de mejora es la obtención de nuevas variedades para producción de aceite de oliva, productivas, con alto rendimiento graso, calidad del aceite y adaptadas a diferentes sistemas de cultivo (León et al. 2015). Para la reciente línea del programa de mejora de olivo orientada a la búsqueda de resistencia a la Verticilosis, se ha perseguido seleccionar genotipos procedentes de progenies de olivo y de material silvestre que presenten características agronómicas de interés y niveles elevados de resistencia a la Verticilosis y ampliar el conocimiento acerca de la herencia de dicha resistencia. En el Centro IFAPA donde se desarrolla este trabajo, se encuentra la Colección Mundial de Variedades de Olivo del BGMO (CAP, UCO, IFAPA) donde se conservan actualmente 885 accesiones de 24 países, muchas de ellas caracterizadas por su nivel de resistencia a la enfermedad, lo que permite seleccionar los genitores de partida a esta línea de investigación (Belaj et al. 2013). Además, se cuenta con un Banco de Germoplasma de Acebuches (BGA) que trata de incluir la gran variabilidad genética de las poblaciones de acebuches de diferentes lugares de España como se ha puesto de manifiesto en evaluaciones a nivel morfológico, agronómico y molecular; material vegetal con el que se han completado los ensayos en esta línea de trabajo.

Figura 2: Crecimiento en invernadero de las plantas de los genotipos evaluados.

Una evaluación agronómica inicial permitió seleccionar 52 genotipos de olivo procedentes de polinización libre de 15 variedades de olivo (Olea europea L.) y 38 genotipos procedentes de tres cruzamientos incluyendo al menos un parental categorizado como resistente a la Verticilosis (‘Changlot Real’ x ‘Dolce Agogia’, ‘Frantoio’ x ‘Arbosana’ y ‘Koroneiki’ x ‘Empeltre’). También se han evaluado otros 64 genotipos con diferente origen: olivos silvestres o acebuches (Olea europaea subsp. europaea var. sylvestris), genotipos de subspecies afines de Olea (Olea europaea subsp. guanchica) y genotipos procedentes de cruzamientos entre la variedad ‘Picual’ y dos acebuches seleccionados. Las plantas fueron generadas por estaquillado vegetativo (figura 2), conservando en campo con ausencia de patógeno las plantas adultas de las que procedían. Fueron inoculadas por inmersión de las raíces con un aislado altamente virulento del patotipo Defoliante de V. dahliae. Después de la inoculación, las plantas se trasplantaron a macetas de plástico con suelo estéril y permanecieron en cámara de crecimiento bajo condiciones de humedad, temperatura (22/24 °C) y fotoperiodo (14 horas de luz) controladas durante 16 semanas (figura 3). Las variedades ‘Picual’ y ‘Frantoio’ se incluyeron como controles de enfermedad susceptible y resistente respectivamente, en los experimentos realizados.

Se ha desarrollado un Índice de Susceptibilidad Relativa (RSI en inglés) que aúna diferentes parámetros de enfermedad comúnmente utilizados. Uno de los parámetros significativos integrados en el RSI es el Índice de Intensidad de la enfermedad durante la duración de los experimentos (figura 4).

La colonización de la planta por el hongo se estimó mediante aislamientos de tejido aéreo y radicular en la muerte de las plantas o al final del experimento. La validación de la colonización tiene lugar tras observaciones microscópicas de las formaciones típicas del hongo como son conidióforos verticilados y microesclerocios, conocidos como estructuras de resistencia del hongo (figura 5).

Los valores medios de enfermedad estimados para los genotipos evaluados se compararon con los valores obtenidos para las variedades controles de referencia susceptible ‘Picual’ y resistente ‘Frantoio’ mediante el test de Dunnett (P=0,05). Este test nos permite clasificar a los genotipos evaluados por su nivel de resistencia, diferenciando tres grupos en nuestros resultados: genotipos resistentes (significativamente diferentes a 'Picual'), susceptibles (significativamente diferentes a 'Frantoio') y moderadamente susceptibles (sin diferencias significativas a ambos controles).

En los genotipos evaluados se ha obtenido una amplia variabilidad en el desarrollo de síntomas a la enfermedad. En base a los valores de RSI, se han podido seleccionar genotipos con un nivel de resistencia similar a ‘Frantoio’ (usado como control resistente) en los tres grupos de material evaluados: ocho genotipos procedentes de variedades en polinización libre (15.4%), diez genotipos procedentes de cruzamientos dirigidos (26,3%) y 13 (23,2%) procedentes de origen silvestre y especies afines (Arias-Calderón et al. 2015abc). Ha sido de interés la evaluación de resistencia a la enfermedad por primera vez de la subsp. guanchica, que ha clasificado como resistentes a la Verticilosis la mayor parte de sus genotipos evaluados. La colonización de la planta por el hongo se estimó mediante aislamientos de tejido aéreo y radicular. Se han encontrado diferentes respuestas entre el nivel de resistencia al desarrollo de síntomas y el grado de colonización de la planta (raíz y tallo), lo que sugiere la existencia un posible mecanismo de tolerancia en la interacción olivo /V.dahliae. Siguiendo las etapas establecidas en el programa de mejora general, los genotipos prometedores continúan en estudio. Los genotipos seleccionados por su nivel significativo de resistencia a la Verticilosis en este trabajo se han establecido en ensayos en campos naturalmente infestados para confirmar el nivel de resistencia a la enfermedad y el interés como posibles futuras nuevas variedades de olivo (figura 6). Asimismo se han utilizado como genitores en nuevos ciclos de mejora: ya se dispone de nuevas descendencias de segunda generación lo que permitirá a medio plazo ampliar conocimientos acerca de la herencia de la resistencia a la enfermedad.

Figura 6. Ensayo de nuevos genotipos establecido en la provincia de Jaén en campo naturalmente infestado por V. dahliae.

La metodología descrita llevada a cabo en estos trabajos, hacen de la selección y desarrollo de posibles nuevas variedades de olivo adaptadas a las necesidades del sector, una tarea que requiere un largo proceso y a menudo costes elevados por las características del cultivo. Por lo tanto, la aplicación de procedimientos y técnicas de biotecnología, puede optimizar la mejora del cultivo del olivo.

Recientes aplicaciones de biotecnología y de la biología molecular se emplean en la mejora del cultivo del olivo para proporcionar identificación varietal, elucidar el origen del cultivo, caracterización de variedades, lucha contra fraudes sobre calidad o estudios de composición de productos y subproductos o desarrollo de micropropagación in vitro, son algunas aplicaciones en las que la comunidad científica del olivar centra su desarrolla en los últimos años.

Como complemento y continuación a los trabajos realizados en la línea de mejora para la resistencia a la Verticilosis del olivo, la biotecnología se presenta como una herramienta útil que contribuiría a ampliar el conocimiento en la interacción olivo/V. Dahliae y desarrollar herramientas de selección precoz. Se diseñaron dos estrategias diferentes que en la actualidad continúan su desarrollo: un primer trabajo basado en un proceso in silico centrado en bases de datos de genes y de proteínas específicas, relacionadas con funciones descritas interesantes en la resistencia en otras especies que pudiese presentar genes homólogos de importancia en olivo; y una segunda estrategia con una aproximación proteómica basada en un análisis diferencial de genotipos que persigue la identificación de proteínas de interés y su futuro clonaje funcional del gen al que codifican. Según la experiencia del grupo de trabajo, se seleccionaron las variedades ‘Picual’ y ‘Frantoio’, por conocerse de forma consistente el desarrollo de síntomas y la reacción a la enfermedad susceptible y resistente, respectivamente.

En ambos casos se ha empleado la metodología de inoculación descrita previamente para los experimentos de evaluación de genotipos, considerando material inoculado y material control libre de enfermedad. Diferentes tiempos de muestro experimental fueron considerados a partir del momento de la inoculación. El material de ambas partes de las planta, raíz y tallo, fue muestreado, identificado y conservado a -80 °C hasta que tuvo lugar la extracción del material para cada uno de los enfoques: ARN para la primera estrategia con modificaciones sobre protocolo de Córdoba-Jiménez (2012) y proteínas para la segunda estrategia con adaptaciones de Wang et al. (2006) (figura 7).

La primera estrategia del trabajo se basa en la búsqueda de posibles genes candidatos implicados en la resistencia a la Verticilosis y que su expresión entre diferentes variedades difiriera significativamente, lo que pudiera permitir profundizar en los mecanismos de resistencia activados en olivo ante la infección por V. dahliae. Una revisión bibliográfica de trabajos previos de otros huéspedes del género Verticillium, permitió identificar genes implicados y aplicarlos a los experimentos descritos. Un total de seis genes fueron utilizados en evaluaciones de expresión génica utilizando la PCR cuantitativa o PCR en tiempo real, metodología utilizada para amplificar y cuantificar las diferentes muestras del diseño experimental planteado.

Los resultados preliminares confirman que la respuesta de los genes seleccionados puede estar implicada en diversas funciones biológicas relacionadas con la reacción de resistencia a la enfermedad, expresión temporal que varía en las variedades evaluadas. Este estudio permite identificar respuestas diferenciales interesantes, como son la mayor expresión significativa de ciertos genes en la variedad resistente ‘Frantoio’ mientras que se pueden encontrar silenciados o con baja expresión en el genotipo en estudio de reacción susceptible conocida, ‘Picual’ (Figura 8). Por el contrario, también resultan interesantes otras reacciones observadas en las que el cultivar susceptible muestra mayor expresión, puesto que podría identificar ausencia de tolerancia a la enfermedad.

La segunda estrategia ha supuesto el primer estudio que se realiza a nivel de proteoma para estudiar la Verticilosis del olivo. La metodología utilizada fue electroforesis bidimensional 2D-DIGE (Figura 9) que después del análisis computacional de la expresión de las muestras, permitió la selección de proteínas diferencialmente expresadas en ambos cultivares y tratamientos (inoculados y no inoculados), y posterior identificación por espectrometría de masas (MALDI-TOF).

Figura 9: Geles de electroforesis bidimensional 2D DIGE de proteínas extraídas de tallo de ‘Picual’ y ‘Frantoio’. Gel con marcadores fluorímetros obtenida en software DeCyder (izquierda), y gel con tinción de Coomassie-Blue, escaneado y anotado previo a extracción de proteínas para la identificación por MALDI-TOF (derecha).

Los primeros análisis permiten encontrar proteínas diferencialmente expresadas en ambas variedades particularmente en raíz, el principal órgano de esta interacción pues es por donde penetra el hongo en la planta y a través del xilema coloniza el resto de la planta. Algunas de las proteínas que hasta la fecha han podido ser identificadas, deberán ser estudiadas y validadas para el mejor conocimiento de la implicación de las funciones realizadas, pudiéndose incluir en base de datos para que sirvan de apoyo a la comunidad científica.

Como conclusión general hasta el momento se desprende que existe una amplia variabilidad de reacción al desarrollo de síntomas de la Verticilosis y de colonización de los genotipos por el hongo. La presencia entre las progenies de genotipos resistentes al desarrollo de síntomas con similar colonización vascular que genotipos susceptibles, sugiere que los conceptos de resistencia/tolerancia para la interacción olivo/V. dahliae podrían variar con el genotipo evaluado. Los genotipos seleccionados en este trabajo se han establecido en ensayos en campos naturalmente infestados para confirmar el nivel de resistencia a la enfermedad y el interés como posibles futuras nuevas variedades de olivo resistentes a la enfermedad, además de haberse utilizado como genitores en nuevos ciclos de mejora. Los resultados obtenidos con la aplicación de técnicas biotecnológicas pueden contribuir en el futuro a mejorar el conocimiento de los mecanismos que se activan ante la infección por el patógeno, proporcionando información de utilidad para el manejo de la enfermedad así como para completar la selección de genotipos de interés y validar los resultados hasta ahora obtenidos.

Estos trabajos se financian con el Proyecto de investigación RTA2013-00019-00-00 del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), parcialmente financiado con fondos FEDER. Rocío Arias Calderón agradece la financiación de su beca FPI-INIA y a la Dra. Branka Javornik, supervisora del trabajo de proteoma en University of Ljubljana (Slovenia).

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