GENÉTICA 23 Figura 1. Esquema de los programas utilizados en el análisis bioinformático. Figura 2. Gráfico volcano plot con los genes diferencialmente expresados (puntos rojos). Figura 3. Análisis de agrupamiento jerarquizado de las muestras de Alto o Bajo contenido en mioglobina en función de los genes diferencialmente expresados. ANÁLISIS DEL TRANSCRIPTOMA Para el análisis del transcriptoma se tomaron muestras de lomo y se almacenaron en tubos criogénicos, los cuales fueron congelados de inmediato en nitrógeno líquido tras el sacrificio. Estas muestras se conservaron a -80 °C hasta su posterior análisis. Para la extracción de ARN total se utilizó un kit comercial de purificación de ARN de alta calidad (RiboPure™, Ambion). El ARN se cuantificó y se valoró su integridad obteniéndose en todas las muestras valores superiores al mínimo exigido para aplicar esta técnica. Se construyeron las librerías para cada muestra y éstas se secuenciaron en un analizador de secuencias Novaseq 6000 de Illumina. Los análisis bioinformáticos se llevaron a cabo utilizado diferentes programas y herramientas informáticas según se muestra en la figura 1. Para decidir si un gen estaba diferencialmente expresado (GDE) se aplicaron criterios basados en el denominado fold change. Cuando las diferencias de expresión entre los grupos de MB Alto y MB Bajo fueron inferiores a -0,58 o superiores a 0,58, con un valor de q menor a 0,10, se consideraron GDE. Los análisis funcionales de los GDE encontrados se realizaron mediante la información de la denominada ontología génica (GO), utilizando el navegador FatiGO y el progama String Tools que permiten una interpretación biológica de los datos. Los resultados del análisis RNA-seq se validaron mediante la técnica de RT-qPCR. Todos las referencias a estos métodos y herramientas pueden ser consultadas en Fernández-Barroso et al. (2022). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Todas las muestras analizadas pasaron los controles de calidad establecidos y entre el 91,8 % y el 94,1 % de las secuencias leídas alinearon correctamente con el genoma de referencia porcino (Sscrofa11.1; tabla 2). Es decir, la reconstrucción del transcriptoma tuvo éxito en las muestras puesto que un porcentaje muy elevado, superior al 90%, puede ser reconocido en el genoma porcino. De un total de 22.452 genes anotados en el genoma de referencia, se han detectado 16.746 expresándose en nuestras muestras. El gráfico del tipo volcano plot (figura 2) muestra todos los genes expresándose en el conjunto de muestras, en el cual los puntos rojos muestran los genes GDE. Se identificaron un total 57 GDE entre los grupos MB Alto y MB Bajo, de los cuales 53 GDE tenían mayor expresión en el grupo MB Alto (log2 FC ≥ 0.58), mientras que los otros cuatro mostraron mayor expresión en el grupo MB Bajo (log2 FC ≤ −0.58). El análisis de agrupamiento jerárquico utilizando los GDE, dividió correctamente las muestras en los grupos MB Alto y MB Bajo, como se aprecia en la figura 3. Los valores de expresión, log2 FC, variaron entre −1.26 a 5.42, siendo los valores extremos para los genes que codifican para las enzimas carbohidrato sulfotransferasa 1 (CHST1, log2 FC = 5.42, p = 2.16x10−5, mayor expresión en el grupo MB Alto) y enoil-CoA hidratasa 1 (ECH1, log2 FC = −1.26, p = 1.33 x 10−4, mayor expresión en el grupo MB Bajo). La tabla 2 muestra una lista de los GDE elegidos por sus funciones clave, que estarían asociadas con las vías biológicas del contenido en MB. Análisis funcionales Los análisis de geontología realizados con la herramienta FatiGO reconocieron diversos procesos biológicos en los que intervenían los GDE (tabla 3). Estos procesos estaban implicados en el metabolismo de las prostaglandinas, el metabolismo de los eicosanoides, el estado de oxidación, el transporte de ácidos grasos, el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno, la proliferación de células T, la organización del citoesqueleto y el tejido conectivo.
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