Análisis directo de drogas en fluidos biológicos mediante columnas poliméricas de fase reversa Shodex ODP2 HP

El análisis de fluidos biológicos como orina, suero o plasma requiere tiempo y esfuerzo, especialmente durante la preparación de la muestra para asegurar una alta sensibilidad en la detección de las drogas presentes en las muestras a analizar. La marca Shodex, distribuida en España por la empresa Anorsa, ha desarrollado una nueva columna polimérica que facilita considerablemente este proceso, permitiendo el análisis directo mediante MS.

Las causas más comunes de supresión en el análisis de moléculas de pequeño tamaño mediante LC-MS son:

1) Presencia de proteínas: La proteína es absorbida por las columnas ODS generando un drástico incremento de la presión incluso después de múltiples inyecciones de BSA (Fig.1). Por otro lado, ODP2 HP mantiene una baja presión gracias al tamaño reducido de poro y a la alta polaridad que presenta, ambas características previenen la absorción de las proteínas y la elución del BSA al principio del cromatograma (Fig.2)

Figura 1 (izq.): Presión de columna tras múltiples inyecciones de BSA.

Figura 2 (derecha):Cromatograma de BSA (albúmina de suero bovino).

2) Elución cerca del volumen muerto de las moléculas altamente polares: En la figura 3 se representa la relación existente entre polaridad y retención. En comparación con las columnas ODS, la columna ODP2 HP presenta una gran capacidad de retención frente a sustancias altamente polares, previniendo la elución de dichas sustancias cerca del volumen muerto.

Figura 3: Relación entre hidrofobicidad y retención.

3) pH del eluyente: Gracias a su composición polimérica, la columna ODP2 permite un amplio rango de eluyentes incluyendo agua, ácidos, bases, tampones y solventes orgánicos polares como el metanol, acetonitrilo y sus mezclas en un rango de pH 3-12.

4) Alta concentración de sales en el eluyente: Se comparó la relación entre la concentración de sal y la capacidad de separación entre la columna ODP2 HP y dos columnas ODS (ODS (A) presenta mejor endcapping que ODS (B)). Cuando se añadieron 10mM de sal como eluyente, cada columna mostró formas de pico óptimas. Sin embargo, cuando la concentración de sal se redujo a 1mM, las dos columnas ODS mostraron colas causadas por las interacciones entre escopolamina y los grupos residuales de silanol en las columnas. Por otro lado, la columna ODP2 HP continuaba mostrando una buena forma de pico a bajas concentraciones de sal sin ninguna absorción, y el tiempo de elución tampoco se veía afectado. Se concluye que la columna ODP2 HP está indicada para aquellos análisis LC/MS en los que la concentración de sal en el eluyente afecta a la supresión iónica de las muestras.

Figura 4: Relación entre la concentración de acetato de amonio y la capacidad de separación.

La técnica de LC/MS es una herramienta efectiva para realizar análisis con alta sensibilidad de drogas, sin embargo, las proteínas presentes en las muestras pueden contaminar el MS o provocar la supresión iónica de la muestra. El pre-tratamiento de las muestras no siempre puede prevenir este problema que conlleva la aparición de pequeños picos de drogas debidos a la supresión iónica por parte de las proteínas.

Figura 5: Análisis de barbital en BSA (LC/MS).

Debido a la baja absorción proteica de las columnas ODP2 HP, la mayoría del BSA eluye al inicio por lo que menos cantidad de BSA llega al MS. De esta forma, solo la sustancia diana (barbital) fue separada del BSA limpiamente. Por el contrario, la presencia de BSA obviamente suprime la señal del barbital cuando se utilizan columnas ODS, mostrando un reducido rango de recuperación.

Finalmente, se muestra un cromatograma correspondiente a una muestra real, acetaminofeno en suero sanguíneo inyectado directamente sin eliminar previamente las proteínas. Esto acorta el tiempo de pre-tratamiento de la muestra.

Figura 6: Análisis directo de acetaminofeno en suero.