Se hace necesario obtener nuevas estirpes de T. delbrueckii diploides, resistentes a etanol, SO₂, cobre y a alta presión de CO₂ para acercarlas lo más posible al nivel tecnológico de las mejores estirpes S. cerevisiae

Torulaspora delbrueckii es probablemente la más adecuada entre las levaduras vínicas no-Saccharomyces para elaborar vino. Esto es así porque tiene mejor rendimiento de fermentación que otras levaduras y además se puede utilizar para optimizar algunos parámetros respecto a los vinos de S. cerevisiae. Sin embargo, el uso de T. delbrueckii conlleva complicaciones y costos económicos adicionales para controlar la fermentación del mosto con respecto al uso convencional de S. cerevisiae, que es sin duda la levadura más fiable para este propósito.

Algunas de las complicaciones de usar T. delbrueckii en bodegas comerciales provienen de sus propiedades fisiológicas cuando crecen en las condiciones de estrés habituales del proceso de vinificación. En este trabajo, revisamos estas propiedades específicas, con un enfoque práctico relacionado con la elaboración de vino. Muchas de las ventajas reivindicadas para Torulaspora se basan en resultados de diferentes estudios de investigación que frecuentemente son contradictorios, o no reproducibles. La explicación más fácil consiste en atribuir estas discrepancias a posibles diferencias de comportamiento de las diferentes estirpes de T. delbrueckii utilizadas en diferentes investigaciones. Sin embargo, es muy posible que los diferentes resultados encontrados en la literatura se deban al comportamiento variable o impredecible de T. delbrueckii dependiendo de las condiciones ambientales. Para obtener la mejora deseada de la calidad del vino, proponemos inocular el mosto exclusivamente con estirpes killer de T. delbrueckii en condiciones apropiadas para lograr su dominio completo de la fermentación, y posteriormente mezclar los vinos resultantes con otros inoculados con S. cerevisiae para optimizar resultados. Por último, se recomienda el uso de T. delbrueckii en cultivos mixtos con S. cerevisiae para la elaboración de vinos espumosos de calidad como el cava.

Torulaspora es un género de levaduras fermentativas que se pueden encontrar en hábitas silvestres donde pueden coexistir con otras levaduras fermentativas como Saccharomyces, Lachancea y Zygosaccharomyces (1). Se conocen al menos seis especies: T. delbrueckii, T. franciscae, T. pretoriensis, T. microellipsoides, T. globosa y T. maleeae (2). Las células vegetativas presentan una morfología esférica en forma de torula, son más pequeñas que S. cerevisiae (Figs. 1A y E) y presentan cierta tendencia a flocular (Fig. 1C), que podría ser interesante para la clarificación de ciertos vinos especiales como el cava. Su ciclo de vida aún no se ha dilucidado por completo. En un principio, se creía que eran haploides, principalmente por su pequeño tamaño celular (3), y porque las tétradas de esporas rara vez se observan en medio de esporulación. Sin embargo, recientemente se ha sugerido que puedan ser diploides y homotálicas (4). Su pequeño tamaño podría explicarse por tener solo 16 cromosomas en la etapa diploide, en lugar de los 32 cromosomas de S. cerevisiae diploide. Todas las especies de Torulaspora se reproducen asexualmente por gemación multilateral (mitosis), y sexualmente (meiosis) mediante ascas que contienen de 1-4 ascosporas, formando tubos conjugativos, principalmente en cultivos en fase estacionaria y medio de esporulación (Figs. 1B y F). Cabe destacar que Torulaspora no requiere un medio de escasez para poder esporular (4, 5), y puede formar esporas en un medio rico como YEPD (Fig. 1D).

Figura 1. Células vegetativas (A, C, y E) y esporas (B, D, y F) de T. delbrueckii (Td) y S. cerevisiae (Sc). Las microfotografías se hicieron con la técnica de Nomarski (células vegetativas) o campo claro (esporas) con un microscopio digital Nikon Eclipse 600 equipado con objetivo 60× (600 aumentos). C: células vegetativas teñidas con azul de metileno. B y F: esporas en medio de esporulación. D: esporas de YEPD-agar teñidas con verde de malaquita.

De todas las levaduras no-Saccharomyces, T. delbrueckii es sin duda la especie más parecida a S. cerevisiae a nivel fermentativo, principal razón por la que ha sido propuesta para su uso industrial en fermentación de vino. Sin embargo, T. delbrueckii presenta algunos inconvenientes a nivel fermentativo, como menor vigor fermentativo y tasa de crecimiento respecto S. cerevisiae en condiciones normales de vinificación, y es desplazada fácilmente por estirpes de S. cerevisiae silvestres o inoculadas (7, 8). Se sabe además que la limitación de oxígeno en cultivos contínuos influye más en T. delbrueckii, con un rendimiento menor en biomasa en la producción a gran escala que en S. cerevisiae (6). Esto supone una limitación importante, ya que la vinificación se realiza en condiciones anaeróbicas estrictas para vinos blancos y espumosos, o en presencia de poco oxígeno al bazuquear periódicamente para vinos tintos.

El efecto de T. delbrueckii sobre la calidad del vino suele ser muy variable, con resultados contradictorios y, a veces, decepcionantes. Mientras algunos autores han descrito que inóculos mixtos de T. delbrueckii + S. cerevisiae aumentan la concentración total de algunos ésteres interesantes (isoamil acetato, etil hexanoato y etil octanoato) respecto S. cerevisiae (9), otros autores han descrito todo lo contrario (10). Esta situación es incluso más complicada en el caso de vinos tintos, dado el eventual desarrollo de bacterias lácticas que pueden promover la fermentación maloláctica en fermentaciones inoculadas exclusivamente con T. delbrueckii, lo cual resulta muy interesante cuando se parte de uva con mucho ácido málico (7, 8). En general, son muy pocos los trabajos publicados que muestran la monitorización y análisis preciso de la población de T. delbrueckii a lo largo de la fermentación. Incluso, en algunos casos las fermentaciones se llevan a cabo en fermentadores con agitación contínua para incrementar la disponibilidad de oxígeno (11), contrario a las condiciones reales en bodega. Para solventar estos incovenientes se puede lograr la dominancia de T. delbrueckii inoculando una alta concentración (del orden de 107 UFC (células viables)/mL) de una estirpe killer en mosto con pocas levaduras silvestres. Así, el crecimiento inicial T. delbrueckii es alto y se convierte en la protagonista de la fermentación. No obstante, como esta levadura es menos resistente que S. cerevisiae a altas concentraciones de etanol, SO₂ (anhídrido sulfuroso) y cobre (Fig. 2), la tasa de fermentación disminuye y la muerte celular aumenta después de fermentación tumultuosa (Fig. 3).

Figura 2. Resistencia de T. delbrueckii (Td) y S. cerevisiae (Sc) a etanol, SO₂ y cobre. Se muestran dos estirpes de cada levadura (Td-1 y Td-2, y Sc-1 y Sc-2, respectivamente). YEPD: YEPD medio rico. SD: SD medio mínimo.

Como consecuencia, la fermentación puede detenerse, desacelerarse y volverse lenta, o continuar debido a la presencia de Saccharomyces contaminantes. Cualquiera de estas situaciones reduce la proporción de T. delbrueckii al final de fermentación, incluso hasta su desaparición (7). Esto es más acusado cuando se realiza inoculación mixta (co-inoculación o inoculación secuencial), donde el predominio de T. delbrueckii, si se produce, suele ser efímero, no más de dos días (6, 8). Se ha caracterizado una estirpe de T. delbrueckii killer de vino que secreta una toxina killer (Kbarr-1) codificada por un virus de RNA de doble cadena. Esta toxina tiene un amplio espectro antifúngico, matando a otras especies de levaduras contaminantes perjudiciales y frecuentes en las fermentaciones industriales (18). La dominancia de esta levadura ya ha sido probada con éxito para vino de mesa blanco y tinto, en presencia de menos de 10⁵ UFC/mL de levaduras silvestres, y un inóculo del orden de 10⁷ UFC/mL de T. delbrueckii killer (7, 8, 16).

Figura 3. Cinética de fermentación (A) y porcentaje de células muertas (B) de un mosto de uva Garnacha inoculado con S. cerevisiae (Sc) y T. delbrueckii (Td). Se muestra la concentración de etanol y azúcares residuales de los vinos.

La inoculación del mosto con T. delbrueckii puede mejorar algunos parámetros del vino en ciertas condiciones específicas. Concretamente puede disminuir la acidez volátil en vino elaborado con mosto de alto contenido en azúcar respecto S. cerevisiae (14), e incrementar la concentración de algunos aromas interesantes como lactonas, ésteres etílicos y tioles volátiles (7, 8, 12, 15). En general, el uso de esta levadura produce una disminución de intensidad a fruta fresca, pero incrementa la complejidad aromática con aromas a fruta pasificada/confitada y pasteleria. Este efecto ocurre principalmente cuando las estirpes de T. delbrueckii killer presentan un alto porcentaje de dominancia, por encima del 70%, durante la fase tumultuosa (7, 8). Hay que considerar que parte de esta complejidad aromática pueda deberse al eventual crecimiento de bacterias lácticas en estas condiciones (7). De acuerdo a este efecto, en principio no es recomendable el uso de esta levadura para elaborar vinos jóvenes de mesa, blancos o rosados. Una excepción sería para aquellas situaciones específicas en las cuales un bajo porcentaje de T. delbrueckii no reduce la intensidad de aroma a fruta fresca, o interactúa con S. cerevisiae para aumentar las cantidades de aromas específicos como tioles volátiles que mejoran claramente la calidad de ciertos vinos de algunas variedades como Sauvignon Blanc (12, 15).

El uso de T. delbrueckii también ha sido probado para elaborar vino espumoso tradicional como cava, tanto para la fase de primera fermentación (vino base) como para la segunda fermentación en botella. Se ha descrito recientemente que T. delbrueckii killer puede dominar más facilmente la fermentación de vino base que T. delbrueckii no-killer, dejando los vinos secos. Sin embargo, la inoculación en exclusividad de T. delbrueckii no completa la segunda fermentación de cava, lo que desaconseja su uso para este propósito. No obstante, la inoculación mixta S. cerevisiae + T. delbrueckii (del orden de 10⁶ UFC/mL y 10⁷ UFC/mL respectivamente), parece una buena opción para mejorar la calidad organoléptica del cava, principalmente porque T. delbrueckii aumenta las cantidades de algunos compuestos interesantes (polisacáridos y aromas) y la estabilidad de la espuma (16). Además, dada la capacidad de estas levaduras para flocular (Fig. 1C), la adición de T. delbrueckii puede ser interesante como coadyuvante ya que funciona de forma similar a la bentonita, haciendo flocular y precipitar las levaduras S. cerevisiae. En cuanto al análisis organoléptico de los vinos base elaborados con T. delbrueckii, resultan claramente distintos a los de S. cerevisiae. Lamentablemente, su carácter más envejecido y menor espumabilidad hacen inapropiado el uso de T. delbrueckii inoculada en exclusividad para la elaboración de vino espumoso de calidad, como ya ha sido descrito previamente para vinos blancos de mesa (8), aunque podría ser apropiada para la elaboración de otros tipos de vinos más envejecidos.

La alta presión de CO₂ es otro de los factores que disminuye la capacidad de T. delbrueckii para competir con otros microorganismos potenciales contaminantes como S. cerevisiae en ambientes estresantes como la segunda fermentación en botella. Esto hace necesario mejorar genéticamente o seleccionar nuevas estirpes de T. delbrueckii para aumentar su resistencia a alta presión de CO₂ y su dominancia durante la segunda fermentación del cava. Otros factores a considerar como susceptibles de ser mejorados genéticamente en T. delbrueckii son la resistencia a etanol, SO₂ y cobre. Basado en algunas experiencias publicadas recientemente (21), algunas estirpes de T. delbrueckii pueden dominar completamente y completar la fermentación de uva estrujada hasta llegar a más de 14º GL (Fig. 3A). Sin embargo, esto ocurre solo en ciertas condiciones muy favorables: presencia de cantidades bajas de Saccharomyces; un inóculo muy grande de T. delbrueckii; agitación frecuente para proporcionar oxígeno adicional; adición de nutrientes que generalmente se encuentran en la piel de las uvas pero que pueden escasear en mosto clarificado; y bajas cantidades de compuestos tóxicos como SO₂, cobre, pesticidas, etc. Incluso en estas condiciones favorables, la fermentación dominada por T. delbrueckii tarda más tiempo que la fermentación dominada por S. cerevisiae, porque el vigor de la fermentación y la viabilidad celular disminuyen más rápidamente en T. delbrueckii que en S. cerevisiae cuando el vino alcanza aproximadamente 5% de alcohol (Fig. 3B) (21). Respecto a la resistencia a etanol, SO₂ y cobre, se pueden apreciar problemas de crecimiento de T. delbrueckii en placas de YEPD-agar suplementado con un 10% de etanol, y en placas de medio mínimo SD-agar suplementado con 125-250 mg/L de SO₂ y 36 mg/L de cobre (Fig. 2). De forma similar, T. delbrueckii puede completar la fermentación en presencia de 50 mg/L de SO₂ (Fig. 4A), aunque puede haber un efecto letal parcial (Fig. 4B), poniendo de manifiesto nuevamente que son menos resistentes a este compuesto que las estirpes vínicas de S. cerevisiae. Además, en el mosto de uva se pueden encontrar cantidades indeseables de cobre procedente del uso de fungicidas en la viña (Fig. 2). De nuevo, S. cerevisiae es más resistente a este compuesto que T. delbrueckii, esto significa que concentraciones de 20-30 mg/L de cobre sería suficiente para reducir drásticamente el vigor fermentativo de T. delbrueckii. En cuanto al pequeño tamaño celular de T. delbrueckii, ésta es sin duda una desventaja importante en la industria del vino respecto a S. cerevisiae (Figs. 1A, C y E). Esto conlleva bajo rendimiento en la producción de biomasa industrial, y dificultades adicionales para recuperar, lavar y deshidratar las levaduras utilizando microfiltración convencional, por esta razón son más caras. T. delbrueckii parece propagarse vegetativamente de forma haploide mientras que S. cerevisiae lo hace de forma diploide o poliploide. Esto último se podría mejorar aumentando el número de cromosomas (ploidía) induciendo la formación de diploides por formación de protoplastos, como ya han conseguido algunos autores para levaduras Torulaspora de panadería (17). Dado que el uso de organismos modificados genéticamente está prohibido en Europa (20), se deben usar para este propósito métodos basados en genética clásica. Por ejemplo, mediante la obtención de híbridos interespecíficos T. delbrueckii × S. cerevisiae con un método natural para levaduras homotálicas basado en la hibridación de esporas, como ya se ha realizado con S. cerevisiae (19).

Figura 4. Cinética de fermentación (A) y porcentaje de la levadura inoculada (B) de mosto de uva Pinot Noir inoculado con S. cerevisiae (Sc) y T. delbrueckii (Td) en presencia y ausencia de 50 mg/L SO₂.

Se hace necesario obtener nuevas estirpes de T. delbrueckii diploides, resistentes a etanol, SO₂, cobre y a alta presión de CO₂ para acercarlas lo más posible al nivel tecnológico de las mejores estirpes S. cerevisiae. Dado que estas estirpes pueden presentar variaciones intraespecíficas, tal como ya existe en S. cerevisiae, no parece difícil aislar y seleccionar estirpes de T. delbrueckii con mejores capacidades fermentativas. Mientras tanto, se recomienda el uso de estirpes killer de T. delbrueckii para la elaboración de vinos tintos muy estructurados procedentes de uvas con un alto contenido en ácido málico, elaboración de vinos dulces naturales procedentes de uvas con un alto contendido en azúcar, y cualquier vino envejecido en los cuales notas aromáticas a fruta pasificada y carácter más oxidado puedan ser apreciadas por los consumidores. En cualquier caso, si el efecto de T. delbrueckii fuera más intenso de lo esperado, se aconseja mezclar los vinos con otros inoculados con S. cerevisiae para optimizar resultados. Por último, se recomienda además el uso de T. delbrueckii en cultivos mixtos con S. cerevisiae para la elaboración de vinos espumosos de calidad como el cava.

Este trabajo ha sido financiado por los proyectos GR18117 (Consejería de Economía e Infraestructuras, Junta de Extremadura) y AGL2017-87635-R (Ministerio de Economía, Industria y Competitividad, Gobierno de España), y cofinanciados con fondos FEDER).

Referencias bibliográficas

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