Desde la Universidad de Chile se ha validado un sistema de pronóstico temprano de la pudrición ácida

La pudrición ácida de los melocotones causada por ‘Geotrichum candidum’ pasó de ser una enfermedad ocasional a un problema de gran importancia en melocotones producidos en Chile desde 2004. La enfermedad fue descrita causando pérdidas en postcosecha de melocotones y nectarinos de exportación cultivados principalmente en la Región Metropolitana y en la Región del Libertador Bernardo O´Higgins (Pinilla, 2005b). La enfermedad se caracteriza por ser una de las pudriciones más desagradables en la postcosecha de melocotón, presentándose además en cerezas y ciruelas.

‘G. candidum’ causa una pudrición blanda de los frutos, donde se produce desintegración de los tejidos, tanto de la epidermis como de la pulpa (Figura 1A). Los frutos afectados exhalan un fuerte olor a fermentación y rancidez (Ogawa et al., 2000). En condiciones de alta humedad relativa se evidencia la presencia de un micelio blanco de aspecto yesoso (Figura 1B), usualmente no filamentoso como en el caso de otros patógenos frecuentes en postcosecha. Este hongo además presenta una fase de tipo levaduriforme, caracterizada por un crecimiento unicelular con multiplicación por yemación, que se observa macroscópicamente como un desarrollo mucoso.

Figura 1A (izq.): Pudrición blanda caracterizada por una conspicua maceración de los tejidos, característica de la pudrición ácida causada por Geotrichum candidum. Figura 1B (dcha.): Desarrollo de micelio blanco en condiciones de humedad alta.

El patógeno es un habitante común de los suelos, donde sus poblaciones son más abundantes (Yaghmour et al., 2012). Está presente en los huertos y sus poblaciones aumentan sobre los frutos en la medida que se aproxima la cosecha. Esta situación se debe al incremento del inóculo en la tierra del huerto producto de los frutos que caen y son colonizados por 'G. candidum'. El polvo que se deposita sobre la fruta sería el principal acarreador de las esporas del hongo hacia la fruta.

Es interesante que la enfermedad haya aumentado su importancia en Chile casi en paralelo con su incremento en California (Michailides y Morgan, 2004), lo que podría estar relacionado con las variedades cultivadas. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en Chile, en California la fruta almacenada en postcosecha desarrolla la enfermedad, mientras que los síntomas de pudrición ácida de los melocotones chilenos se observan mayoritariamente en los mercados de destino, sin embargo, las contramuestras de fruta dejadas en origen habitualmente presentan bajos niveles de la enfermedad.

'G. candidum' es un patógeno oportunista que requiere de heridas para infectar los frutos y los síntomas de la enfermedad se han observado mayoritariamente en variedades de maduración no uniforme

'G. candidum' es un patógeno oportunista que requiere de heridas para infectar los frutos y los síntomas de la enfermedad se han observado mayoritariamente en variedades de maduración desuniforme, donde quillas y hombros sufren un ablandamiento más temprano que el resto del fruto. Existe una relación directa entre la madurez de la fruta y el desarrollo de la pudrición ácida (Yaghmour et al, 2012), aparte de esta mayor susceptibilidad, la fruta más madura es a la vez más susceptible a sufrir heridas. Además, se han observado daños en la epidermis de la fruta que podrían ser de origen químico o físico y que erróneamente se han atribuido al patógeno, cuando en realidad corresponden a lesiones que el patógeno aprovecha para generar las infecciones (Figura 2).

Figura 2: Lesiones superficiales en la epidermis de un melocotón del cultivar Reach Lady inspeccionado en el momento de su llegada al mercado norteamericano.

Estudios in vitro realizados por Pinilla (2005a) demostraron que los fungicidas propiconazole y tebuconazole son efectivos en la inhibición del crecimiento de 'G. candidum'. Estos activos se utilizan actualmente en forma comercial siendo aplicados 7 a 10 días antes de la cosecha en aquellos huertos con historial de la enfermedad. Otro aspecto importante de esta enfermedad es que este patógeno contamina las instalaciones de las líneas de embalaje y desde allí se distribuye a otros frutos, razón por la cual las centrales de embalaje han esmerado esfuerzos en la desinfección de las líneas de embalaje a diario, especialmente cuando se realizan los cambios de lotes de fruta para evitar contaminaciones entre la fruta proveniente de diferentes huertos. Estudios realizados por Yaghmour et al. (2012) identificaron la zona del vaciado de la fruta (muestreando la cinta que recibe la fruta) como la de mayor presencia de inóculo de 'G. candidum', mientras que la zona de los cepillos fue la de menor ocurrencia del patógeno.

La baja frecuencia de aparición de la pudrición ácida en condiciones de almacenamiento prolongado en el país, hace difícil el estudio de la enfermedad. Para conocer aspectos relevantes de la epidemiología y control de la enfermedad hemos desarrollado una metodología que nos permite observar las poblaciones epífitas (sobre el tejido vegetal) del patógeno sobre la fruta, la que consiste básicamente en congelar la fruta y posteriormente permitir el desarrollo saprofítico del hongo, determinando así la cantidad de frutos que presentan al patógeno en su superficie. Adicionalmente, hemos desarrollado un protocolo que puede ser utilizado para pronosticar la posible ocurrencia de esta patología.

En la temporada 2007–2008 se inició un primer estudio que se inclinaba a determinar el efecto de fungicidas aplicados en precosecha sobre la pudrición ácida en melocotones del cultivo Early Rich provenientes de una huerta comercial con historial de pudrición ácida, ubicado en Catemu, San Felipe. La fruta fue tratada en forma comercial en la huerta con 4 fungicidas (Cuadro 1) una semana antes de la cosecha comercial. Posterior a la cosecha, la fruta se embaló comercialmente y se almacenaron 4 cajas con 40 frutos cada una, en frigorífico durante 35 días, a 0 +/- 1 °C. Posteriormente, fueron dejadas a temperatura ambiente 4 días y se determinó el porcentaje de frutos con desarrollo de pudrición ácida. Aquellos frutos que no desarrollaron pudrición ácida fueron congelados a -17 °C durante 48 horas y luego mantenidos en cámaras húmedas 4 días más para finalmente determinar el porcentaje de frutos con desarrollo saprofítico de 'G. candidum'.

Los niveles de pudrición ácida observados en la fruta después de 35 días de almacenamiento fueron muy bajos, sin que se pudieran extraer conclusiones respecto de la efectividad de los tratamientos químicos realizados en el campo. Sin embargo, la mayoría de la fruta de todos los tratamientos (un 92% del total) desarrolló colonias de 'G. candidum' después de haber sido congelada, evidenciando que la fruta presentaba contaminación superficial con el patógeno (Cuadro 1). Estos resultados demuestran que la sola presencia de inóculo sobre la fruta no es suficiente para el desarrollo de la pudrición ácida.

Cuadro 1: Porcentaje de melocotones Early Rich con desarrollo de pudrición ácida y desarrollo de poblaciones epífitas de 'G. candidum' tras ser tratados con fungicidas en precosecha, embalados en embalaje comercial y almacenados 35 días en frigorífico. El porcentaje de poblaciones epífitas se determinó después de haber congelado la fruta a -17 °C durante 4 días. ^X Letras iguales en las columnas indican diferencias no significativas según prueba de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05).

Para confirmar la utilidad de la metodología de congelación y poder determinar fehacientemente la efectividad de los tratamientos fungicidas, se montó un segundo ensayo en melocotón del tipo Everts, ubicado en la huerta experimental de la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile. La fruta fue inoculada artificialmente con una suspensión de 1 x 105 conidias/mL de la cepa GNRDC de 'G. candidum' proveniente de cultivos puros de 7 días, utilizando un atomizador manual. Luego, a los 7 días, la fruta fue rociada mediante atomizadores manuales con diferentes fungicidas (Cuadro 2) y cosechada una semana más tarde, siendo inmediatamente congelada a -17 °C durante 4 días para que, tras un periodo de 4 días a temperatura ambiente, proceder a determinar el porcentaje de frutos con desarrollo del patógeno.

La fruta de la huerta experimental no presentó contaminación con el patógeno, mientras que la fruta inoculada en su totalidad presentó desarrollo de 'G. candidum', demostrando la efectividad de la inoculación realizada. Por otra parte, todos los fungicidas empleados disminuyeron las poblaciones epífitas del patógeno, siendo esta inhibición mayor con propiconazole y con tebuconazole (Cuadro 2).

Cuadro 2: Porcentaje de melocotones Everts con desarrollo de poblaciones epifitas de 'G. candidum' tras ser inoculados en el árbol y tratados con fungicidas. El porcentaje de poblaciones epífitas se determinó congelando la fruta a -17 °C. ^X Letras iguales en las columnas indican diferencias no significativas según prueba de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05).

Para determinar el efecto residual de los fungicidas, se diseñó un nuevo ensayo, en melocotones de la variedad Ross ubicados en la misma huerta experimental, en la cual se aplicaron los fungicidas 21 días antes de la cosecha y luego fueron inoculados con el patógeno a los 1, 5, 10, 15 y 20 días después del tratamiento fungicida. Tras la cosecha, los melocotones fueron sometidos al proceso de congelación previamente descrito, determinándose los porcentajes de frutos con desarrollo de poblaciones del patógeno. El ensayo se realizó con un diseño de bloques completos al azar donde cada bloque correspondió a un árbol y en cada árbol se consideró una repetición compuesta por 20 frutos para cada tratamiento.

Este ensayo permitió evidenciar que los fungicidas propiconzole y tebuconazole presentaron un efecto residual de al menos 15 días desde su aplicación, disminuyendo significativamente las poblaciones del patógeno sobre los frutos (Figura 3). Estos resultados a su vez, corroboraron la necesidad de que las aplicaciones en las huertas se realicen dentro de los 15 días anteriores a la cosecha. Por otra parte, el extracto de cítrico redujo efectivamente las poblaciones del patógeno durante los primeros 5 días, observándose valores variables con posterioridad. Estos fungicidas se caracterizan por una corta efectividad residual y por tanto no debería esperarse un efecto sobre las poblaciones del patógeno más allá de unos 5 días desde la aplicación.

Figura 3: Poblaciones epífitas de 'G. candidum' en melocotones Ross tratados con fungicidas e inoculados con una suspensión conidial del patógeno. El porcentaje de poblaciones epífitas se determinó congelando la fruta a -17 °C. La comparación se realizó entre tratamientos para cada periodo de aplicación, por separado. Letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias significativas según prueba de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05). Contaminaciones por 'Rhizopus' impidieron un efectivo recuento de las poblaciones del patógeno en los melocotones tratados con propiconazole a los 5 días, perdiéndose dicha información.

Uno de los problemas de la metodología de congelamiento de los frutos es el desarrollo de hongos saprófitos que dificultan el recuento de las colonias de 'G. candidum', especialmente' Rhizopus', que crece rápida y profusamente, colonizando gran parte de la fruta e inhibiendo el desarrollo de otros hongos. El crecimiento de colonias de 'Penicillium', inicialmente blancas y subcirculares pueden además ser confundidas con colonias de 'G. candidum'. En consecuencia, en la temporada 2008-2009 se realizó un ensayo que consistió en tratar con fungicidas la fruta antes de ser congelada con el objeto de inhibir el crecimiento de saprófitos indeseados y permitir la cuantificación de las colonias de 'G. candidum'. Para ello se utilizó melocotón Zee Lady provenientes de tres huertas comerciales con historial de pudrición ácida, que fueron tratados por aspersión con una combinación de fungicidas (Cuadro 3), sobre las mismas bandejas en que se colocaron al interior del congelador y luego fueron congelados completamente e incubados durante 4 días. La fruta se obtuvo de la cosecha comercial y se utilizaron 4 repeticiones correspondientes a 4 cajas de 48 frutos. Se utilizó el fungicida Dicloran orientado a inhibir el crecimiento de 'Rhizopus', en mezcla con Imazalil, Iprodione, Pyrimethanil o Benomilo, con el objeto de ampliar el espectro de acción e inhibir el desarrollo de contaminantes tales como 'Penicillium' y 'Cladosporium', entre otros.

Cuadro 3: Tratamientos fungicidas utilizados para inhibir el desarrollo de saprófitos indeseados y permitir el recuento de las poblaciones epífitas de G. candidum. ¹ Producto comercial por litro de solución.

Sólo 3 de las 4 mezclas de fungicidas lograron incrementar el recuento de 'G. candidum' sobre los frutos (Cuadro 4), observándose una inhibición del crecimiento del patógeno en melocotones tratados con Dicloran + Imazalil, siendo atribuible dicho efecto al Imazalil. Por otra parte, 'Penicillium', 'Cladosporium' y 'Aspergillus' fueron inhibidos por todas las mezclas utilizadas, mientras que si bien 'Rhizopus' se desarrollo sobre los melocotones, su crecimiento no fue expansivo, permitiendo el crecimiento de otros hongos, especialmente de 'Geotrichum'.

Cuadro 4: Porcentaje de melocotones Zee Lady con desarrollo de colonias de diferentes hongos saprófitos luego de ser congelados durante 4 días (Promedio de tres huertas comerciales con historial de pudrición ácida). ^x La contabilización de cada hongo se realizó en todos los frutos, permitiendo que un mismo fruto fuera enumerado más de una vez. ^y Letras iguales en las columnas indican diferencias no significativas según prueba de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05).

Para determinar directamente el efecto de los fungicidas sobre el patógeno se diseñó otro ensayo en que se inocularon melocotones de la variedad Ross, ubicados en el huerto experimental, con una suspensión de 1 x 105 conidias de la cepa GNRDC de G. candidum proveniente de cultivos puros de 7 días. La fruta fue cosechada 7 días después, tratada con los fungicidas (Cuadro 3) e incubada en cámara húmeda.

Este ensayo demostró efectivamente la mayor eficacia de la metodología de congelación cuando se utiliza una mezcla de fungicidas, para determinar la presencia del patógeno epífitamente sobre la fruta. Todas las mezclas incrementaron significativamente el recuento de 'G. candidum' que alcanzó sólo al 55% de los frutos que no fueron tratados con fungicidas previo al congelamiento (Cuadro 5). En este caso, 'Rhizopus' fue efectivamente inhibido con las mezclas de fungicidas, lo que habría permitido un mayor desarrollo de los restantes hongos, observándose no sólo un mayor recuento de 'Geotrichum', sino que además, un mayor número de colonias de 'Cladosporium' en la fruta tratada con las mezclas, salvo con la que incluyó a Iprodione (Cuadro 5).

Cuadro 5: Porcentaje de melocotones Ross con desarrollo de colonias de 'Geotrichum candidum' y otros hongos saprófitos, tras ser congelados durante 4 días (Huerto experimental, Universidad de Chile). ^x La contabilización de cada hongo se realizó en todos los frutos, permitiendo que un mismo fruto fuera enumerado más de una vez. ^y Letras iguales en las columnas indican diferencias no significativas según prueba de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05).

En la Figura 4 se observa el abundante crecimiento de los hongos saprófitos sobre los melocotones previamente congelados en ambos testigos sin fungicidas (inoculado y no inoculado). El abundante crecimiento expansivo de 'Rhizopus' inhibe y dificulta el recuento de colonias de 'Geotrichum candidum', así como de otros hongos. Todas las mezclas de fungicidas produjeron una importante inhibición del crecimiento de 'Rhizopus', así como de otros saprófitos, permitiendo visualizar en muy buena forma el desarrollo de 'G.candidum' sobre la fruta. La mezcla de Dicloran + Pyrimrthanil generó la mayor expresión del patógeno, no sólo el que se desarrolló en toda la fruta, si no además el que tuvo un desarrollo extensivo en cada uno de ellos, siendo en consecuencia la mezcla seleccionada para la metodología de determinación de poblaciones epífitas de 'G. candidum' sobre melocotones y nectarinos.

Figura 4: Melocotones Ross con desarrollo de colonias de 'Geotrichum candidum' y otros hongos saprófitos, tras ser inoculados, tratados con diferentes mezclas de fungicidas, congelados durante 4 días y mantenidos en cámara húmeda 5 días más. 1: Testigo no inoculado sin fungicidas; 2: Testigo inoculado sin fungicidas; 3: Dicloran + Imazalil; 4: Dicloran + Iprodione; 5: Dicloran + Pyrimethanil; y 6: Dicloran + Benomyl.

Finalmente, para validar la metodología, se realizó un ensayo que tendía a determinar la posible variación en los porcentajes de frutos con poblaciones epífitas del patógeno en poscosecha. Para ello, se tomaron muestras de melocotones de la variedad Sweet September provenientes de la cosecha comercial de dos huertas con historial de pudrición ácida y dos huertas sin historial de pudrición ácida. La fruta fue obtenida en tres etapas del proceso de poscosecha, a la llegada a la planta de embalaje, a la salida del hidroenfriado y en la caja embalada, al final del proceso de embalaje. La fruta se obtuvo en la planta embaladora de la empresa Viconto, ubicada en Maipo, Región Metropolitana. En todos los huertos con historial de pudrición ácida se realizó una aplicación de Propiconazole en precosecha, mientras que toda la fruta fue tratada con hipoclorito de sodio (75 ppm de cloro activo) en el hidroenfriado y con fenhexamida (Teldor 500 SC) + Iprodione (Rovral 4 Flo) aplicados junto a la cera (Primafresh 50 V) en la línea de selección y embalaje. Se utilizaron 4 repeticiones correspondientes a 4 cajas de 44 frutos por cada punto de muestreo y por cada huerta. La fruta se trató con Dicloran + Pyrimethanil (Botrán 75 WP 1,5 g/L + Pyrus 400 SC 1,5 cc/L), se congeló durante 4 días a -17 °C e incubó 4 días en cámaras húmedas en el laboratorio de Fitopatología de Postcosecha de la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Univ. de Chile.

A la llegada a la planta de embalaje se observó una notoria diferencia en la cantidad de frutos con poblaciones epífitas de 'G. candidum' entre las huertas con y sin historial de pudrición ácida, siendo ésta más de tres veces mayor en los huertos con historial (Cuadros 6 y 7). La cantidad de fruta con presencia del patógeno no varió tras haber sido sometida al hidroenfriado, evidenciando que no existiría redistribución del inoculo en este tratamiento, como ha sido propuesto por algunos investigadores. Sin embargo, sobre un 96% de los frutos de ambos tipos de huerto presentaron poblaciones epífitas del patógeno al final del proceso de embalaje, ratificando que en esta parte del proceso se produce una redistribución del inoculo (Cuadro 6 y 7; Figuras 5 y 6). La planta en que se realizó el estudio tiene un estricto protocolo e limpieza de los equipos de embalaje, la cual se realiza cada vez que se cambia de un lote de fruta a otro, poniendo un mayor cuidado cuando se procesa fruta de huertos con historial de pudrición ácida.

Cuadro 6: Porcentaje de frutos con poblaciones de 'Geotrichum candidum' y otros hongos sapófitos en tres etapas de postcosecha en melocotones Sweet September (promedio de dos huertos con historial). ^x La contabilización de cada hongo se realizó en todos los frutos, permitiendo que un mismo fruto fuera enumerado más de una vez. ^y Letras iguales en las columnas indican diferencias no significativas según prueba de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05).

La información obtenida en este estudio permite inferir que la redistribución del inóculo no ocurre exclusivamente entre la fruta de diferentes lotes, sino que además se produce entre los frutos de un mismo lote y dependerá muy probablemente de la cantidad de inóculo presente en cada lote. En este caso, lotes provenientes con un 23% de frutos contaminados llegan a casi un 100% de frutos contaminados al final de la línea de embalaje. Sin embargo, como ya se indicó anteriormente, a pesar de que la mayor parte de la fruta presenta inóculo del patógeno, sólo una parte de ella normalmente desarrolla pudrición ácida. Debido a que el patógeno requiere de heridas para penetrar los frutos e iniciar las pudriciones, es de suma importancia manejar las condiciones de manipulación, conservación y transporte en postcosecha para reducir la incidencia de la enfermedad ya que es presumible que el patógeno se encuentre presente sobre gran parte de la fruta.

Cuadro 7: Porcentaje de frutos con poblaciones de 'Geotrichum candidum' y otros hongos sapófitos en tres etapas de postcosecha en melocotones Sweet September (promedio de dos huertas sin historial). ^x La contabilización de cada hongo se realizó en todos los frutos, permitiendo que un mismo fruto fuera enumerado más de una vez. ^y Letras iguales en las columnas indican diferencias no significativas según prueba de comparación múltiple de Tukey (p < 0,05).

Figura 5: Desarrollo de 'Geotrichum candidum' en tres etapas de postcosecha en melocotones Sweet September provenientes de un huerto sin historial de pudrición ácida (huerta Fernando Zagal). 1: bins llegada a planta, 2: salida de hidroenfriado y 3: caja embalada.

Figura 6: Desarrollo de 'Geotrichum candidum' en tres etapas de postcosecha en melocotones Sweet September provenientes de una huerta con historial de pudrición ácida (huerta El Resguardo). 1: bins llegada a planta, 2: salida de hydroenfriado y 3: caja embalada.

La metodología descrita en este trabajo permite conocer los niveles de contaminación que trae la fruta desde el campo y puede ser utilizada como un protocolo de predicción de la pudrición ácida. Pero adicionalmente, esta metodología puede ser utilizada para determinar el efecto de diversas prácticas, realizadas en la huerta, destinadas a minimizar el inóculo del patógeno sobre la fruta.

Finalmente, de acuerdo a los resultados obtenidos en los diversos ensayos realizados es posible concluir que el control de la pudrición ácida de la fruta de hueso se logra integrando medidas de huerta y de poscosecha. A nivel de la huerta es necesario evitar al máximo la producción de polvo en los caminos, que permite en gran medida la llegada del inóculo a la fruta, y realizar los tratamientos químicos con fungicidas efectivos lo más cerca de la cosecha posible. En poscosecha, si bien los resultados presentados muestran una baja efectividad de la desinfección de las instalaciones de embalaje, esta no puede eliminarse, sino incrementarse. Las medidas que en mayor medida impactarán la ocurrencia de la enfermedad, sin embargo, son el procurar cosechar la fruta con el grado de madurez óptimo que permita un almacenaje y transporte de la fruta sin que se produzcan heridas en ella y realizar un manejo cuidadoso de la fruta durante el almacenamiento y el transporte.

Bibliografía

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• Pinilla, B. 2005 a. Eficiencia de fungicidas 'in vitro' en la inhibición del hongo Geotrichum candidum agente causal de la pudrición acida en duraznos. XV Congreso de la Sociedad Chilena de Fitopatología. Facultad de Agronomía, Universidad de Tarapacá. Arica, Chile. 15-18 diciembre, 2005.
• Pinilla, B. 2005 b. Fuentes de inóculo de la pudrición ácida causada por Geotrichum candidum en duraznos. XV Congreso de la Sociedad Chilena de Fitopatología. Facultad de Agronomía, Universidad de Tarapacá, Arica, Chile. 15-18 diciembre, 2005.
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