Los cultivos herbáceos afectados por la salinidad no suelen presentar daños visibles en las hojas, aunque su desarrollo y productividad disminuyen
Aplicación de imagen hiperespectral para observar el efecto de la salinidad en hojas de lechuga
M.A. Lara y L. Lleó (LPF-Tagralia. Dpto. de Ciencia y Tecnología Aplicadas a la Ingeniería Técnica Agrícola, E.U.I.T.Agrícola, UPM)B. Diezma y M. Ruiz-Altisent (LPF-Tagralia. Departamento de Ingeniería Rural, E.T.S.I. Agrónomos, UPM)J.M. Roger (Irstea)Y. Garrido y M.I. Gil (Grupo de Investigación en Calidad, Seguridad y Bioactividad de Alimentos Vegetales, Cebas-CSIC)16/12/2013
La salinidad del suelo y/o del agua de riego es un factor determinante en el crecimiento de la mayoría de cultivos hortícolas, llegando a causar verdaderos problemas en la agricultura, principalmente en regiones áridas o semiáridas. Los suelos salinos ocupan una gran superficie en el sureste español, y la lechuga (Lactuca sativa L.) es uno de los cultivos hortícolas de mayor implantación en esta área; su producción se destina principalmente para consumo en fresco y en productos cuarta gama.
La salinidad afecta al crecimiento de los cultivos de dos formas, principalmente: (a) incrementando el potencial osmótico del suelo, lo que provoca que el agua esté menos disponible para las plantas, y (b) mediante los efectos específicos de determinados elementos presentes en concentración excesiva. Bajo condiciones de salinidad (NaCl) en el suelo o en el agua de riego, los cultivos muestran efectos como la reducción del crecimiento, la reducción del índice de área foliar, el desarrollo de raíces más cortas y finas, la acumulación de Na y Cl en las hojas hasta niveles que pueden provocar quemaduras, la reducción de los espacios intercelulares, la reducción del contenido en clorofila y carotenoides, y a niveles extremos deficiencias en K, Ca y Mg (Shannon y Grieve, 1998).
Los cultivos herbáceos afectados por la salinidad (en umbrales moderados) no suelen presentar daños visibles en las hojas, aunque su desarrollo y productividad disminuyen. Sin embargo, cuando la salinidad provoca desequilibrios en la concentración de determinados elementos minerales pueden aparecer daños en el tejido foliar (Eraslan et al., 2007; Carassay et al., 2012).
La tolerancia a la salinidad de la lechuga depende en gran medida de la variedad cultivada, aunque influyen otra serie de factores del cultivo, del suelo y ambientales. En términos generales la lechuga es un cultivo moderadamente sensible a la salinidad, que a partir de un valor de conductividad eléctrica (CE) del suelo de 1,3 dS/m ve afectado su desarrollo. Algunos estudios indican que las condiciones óptimas de crecimiento de la lechuga, en lo que a salinidad se refiere, son una conductividad eléctrica del suelo inferior a 1,3 dS/m y/o una conductividad eléctrica del agua de riego inferior a 0,9 dS/m.
Sin embargo, un moderado estrés salino en el cultivo de la lechuga también tiene efectos positivos en la conservación tras su recogida ya sea para consumo en fresco o para producto cuarta gama. Lechugas cultivadas con mayor salinidad presentan menor actividad de la polifenoloxidasa y de la peroxidasa tras el corte y en los 7 días posteriores. También sufren menor pardeamiento enzimático y muestran menor reducción en el contenido total de polifenoles y de actividad antioxidante tras 3 días de almacenamiento (Chisary et al., 2010). A su vez, se produce una menor proliferación de bacterias mesófilas, mohos y levaduras (Scuderi et al., 2011). Todo esto se traduce en un aumento de la vida útil del producto debido a una menor y más lenta degradación enzimática y microbiológica.
En el presente trabajo se utilizan técnicas de imagen hiperespectral como procedimiento no destructivo para identificar la influencia del estrés salino en lechuga ‘baby’ recién recolectada
Durante los últimos años se han ido explorando diversas técnicas como posibles métodos instrumentales para la evaluación de la calidad de los productos agroalimentarios. Recientemente la imagen hiperespectral se ha perfilado como una técnica analítica prometedora con perspectivas, tras sucesivas fases de investigación, en los procesos de control y automatización de la industria. La IHS genera mapas espaciales de la variación espectral de la muestra conocidos como datacubos o hipercubos. Estos hipercubos son bases de datos tridimensionales que contienen las dos dimensiones espaciales y la dimensión espectral, esto es, un espectro para cada píxel. Constituye un híbrido entre las técnicas de imagen convencionales y la espectroscopia visible (VIS) y en el infrarrojo cercano (NIR).
Uno de los principales retos de la visión hiperespectral es el manejo y análisis de esas grandes y complejas bases de datos para la extracción de la información relevante contenida en ellas. El punto de partida para ello lo constituyen los métodos de pre-procesado de espectros (normalización, suavizado, centrado, diferenciación, etc.) y análisis multi-variante (técnicas de correlación, análisis de componentes principales, análisis discriminantes, etc.) aplicados tradicionalmente a la espectroscopia; en el caso de la visión hiperespectral estos procedimientos pueden aplicarse a toda la imagen o a sub-poblaciones de píxeles representativos de la variabilidad de las muestras.
La imagen hiperespectral se ha utilizado ampliamente para detectar niveles de salinidad en suelos y vegetación por teledetección, desarrollándose numerosos índices espectrales (Hamzeh et al., 2013). Sin embargo, no se ha empleado a nivel local para observar los efectos de la salinidad en los tejidos. En el presente trabajo se utilizan técnicas de imagen hiperespectral como procedimiento no destructivo para identificar la influencia del estrés salino en lechuga ‘baby’ recién recolectada. Constituye el primer paso en el desarrollo de un sistema de visión que permita la monitorización del cultivo durante su crecimiento con el objetivo de modular las concentraciones de ClNa en la solución nutritiva del cultivo.
El experimento
Para la realización del trabajo, se cultivaron 40 plantas de lechuga ‘baby’ en cultivo hidropónico, utilizando ocho cubetas provistas de una tapadera con orificios (Fotografía 1). En cada orificio se colocó una plántula hasta un total de cinco por cubeta. Las ocho cubetas se dividieron en cuatro grupos de dos, correspondientes al tratamiento de control (Ct) y a los tratamientos de salinidades S1, S2 y S3 (S1 50 mM NaCl, S2 100 mM NaCl y S3150 mM NaCl, respectivamente). Se empleó solución 'Hoagland' como solución control, a la que se le añadieron las tres soluciones salinas. Tras el desarrollo de las lechugas, llegado el punto de recolección, se seleccionaron 10 hojas de dimensiones similares para cada uno de los cuatro tratamientos.
Fotografía 1: Cultivo hidropónico de lechuga ‘baby’; cada tratamiento de salinidad se aplicó a 2 cubetas.
Las imágenes se adquirieron con un sistema de visión hiperespectral (VNIR 400 a 1000 nm, 189 longitudes de onda de Headwall Photonics HyperspecTM, con lámpara halógena). La resolución espacial fue de 0,26 mm/píxel. Las muestras fueron escaneadas mediante un sistema de barrido lineal (Fotografía 2). Durante la adquisición se computaron imágenes hiperespectrales de reflectancia relativa considerando como blanco una pastilla de sulfato de bario.
Fotografía 2: Izquierda: hoja de lechuga ‘baby” correspondiente al tratamiento control preparada para adquirir la imagen hiperespectral. Derecha: Cámara hiperespectral utilizada en el trabajo.
Con las hojas restantes, paralelamente, se realizó el análisis de su contenido en agua y de su potencial osmótico. El contenido en agua de las hojas se determinó mediante el método descrito por Agüero et al. (2011) con modificaciones. Se tomaron 20 g de trozos de hojas por tratamiento, se homogenizaron con una picadora comercial y se dividieron en 3 réplicas de unos 5 g por tratamiento. Las muestras se secaron en una estufa con ventilación forzada a 65 °C (Thermocenter T C40/100, Salvis Lab, Rotkreuz, Suiza) durante 48 h hasta alcanzar un peso constante. Para determinar el potencial osmótico de las hojas (Ψs) se tomaron 3 réplicas de 5 g de trozos de hojas por tratamiento y se congelaron a -20 °C. Las muestras se centrifugaron a 2.800 g durante 15 min (Centronic centrifuge, J.P. Selecta, Barcelona, España). El sobrenadante se analizó con un micro-osmómetro (Roebling 13DR, Löser Messtechnik, Berlin, Alemania)
Las imágenes hiperespectrales de las hojas de lechuga obtenidas se dividieron en 2 grupos diferenciados: un set de calibración con el que generar los modelos de predicción, compuesto por 7 hojas de cada uno de los 4 grupos de salinidad (28 hojas en total); y un set de validación sobre el que comprobar los modelos generados, compuesto por las 3 hojas restantes de cada grupo de salinidad (12 hojas en total).
En cada imagen hiperespectral se seleccionaron n=32.000 espectros correspondientes a la superficie verde de la hoja (Figura 1), evitando el nervio principal, y se computó el espectro medio para cada hoja. Sobre el set de calibración, formado por 28 espectros medios, se aplicaron, sucesivamente, dos tipos de pretratamientos de espectros para corregir la variabilidad interferente (ajena al factor estudiado). Sobre este set de espectros pretratados se computó un Análisis de Componentes Principales (PCA).
Figura 1: Izquierda: planos correspondientes a diferentes longitudes de onda (800 nm y 900 nm) de una imagen hiperespectral de lechuga. Derecha: espectros correspondientes a una pequeña región de la superficie de la hoja de lechuga de la imagen hiperespectral.
Las imágenes hiperespectrales de las hojas se proyectaron sobre uno de los componentes principales obtenidos, el que se mostró más sensible al tratamiento de salinidad, consiguiendo las correspondientes imágenes artificiales de las proyecciones, en las que el valor en cada píxel se visualiza mediante una escala de color. Posteriormente se computaron los histogramas relativos de estas imágenes artificiales de las hojas y sus correspondientes modas. Por último se realizó una clasificación no supervisada de estos histogramas, tratando de comprobar si la agrupación obtenida se relacionaba con el nivel de salinidad al que habían estado sometidas las hojas.
El contenido en agua y las imágenes hiperespectrales de las hojas
La Figura 2 presenta los resultados en cuanto a contenido en agua y potencial osmótico de las hojas. Como se puede apreciar, el contenido en agua de las hojas fue disminuyendo progresivamente a partir del tratamiento S1, el cual muestro niveles iguales al tratamiento control. En el potencial osmótico se observa una disminución progresiva a partir del menor nivel de salinidad, S1.
Figura 2: Valores medios y desviaciones típicas del contenido en agua y del potencial osmótico para los diferentes tratamientos de salinidad.
Con los espectros medios de cada hoja se computó el espectro medio correspondiente a las 10 hojas de cada uno de los 4 niveles de salinidad. La Figura 3 muestra dichos espectros medios para las hojas del grupo control (Ct) y del grupo de mayor salinidad (S3). Las principales diferencias se pueden observar en el pico situado sobre 550 nm, en el valle a 680 nm y en la zona del infrarrojo.
Figura 3: Espectros medios de reflectancia relativa de las hojas del tratamiento control (Ct), en azul, y del tratamiento de mayor salinidad (S3), en rojo.
A 550 nm se observa una disminución en la altura del pico a mayor salinidad de las hojas. Este pico se encuentra en la zona del espectro visible correspondiente al color verde. Parece, por tanto, que cuanto mayor es la salinidad, menor reflectancia del color verde se produce en las hojas. En torno a 680 nm (banda de absorción de la clorofila) se observa un incremento en el nivel de reflectancia al aumentar la concentración de salinidad, que puede deberse a un menor contenido de clorofila. Por último, se produce un aumento de la reflectancia en el infrarrojo en el tratamiento de mayor salinidad respecto del tratamiento control (efecto similar al que se produce en hojas bajo estrés hídrico). Todo ello en consonancia con la bibliografía que refiere descensos de clorofila y del contenido en agua en cultivos sometidos a condiciones salinas.
Después del pretatamiento y de aplicar el PCA a los espectros del set de calibración se seleccionó el primer componente PC1 por presentar la mayor relación con la salinidad. Se obtuvo así un modelo lineal en el que los coeficientes por los que se multiplica cada longitud de onda se representan en la Figura 4.
Figura 4: Componente principal PC1 del PCA; indica el valor del coeficiente para cada longitud de onda en el modelo lineal establecido.
La Figura 5 muestra las imágenes virtuales del valor obtenido en cada píxel al aplicar el modelo generado por el PCA. Se aprecian claramente las diferencias entre las hojas Ct y las hojas sometidas al tratamiento S3, evolucionando desde píxeles azulados hacia naranjas y rojizos según aumenta la concentración de salinidad.
Figura 5: Imágenes virtuales obtenidas al aplicar el modelo generado mediante PCA a todos los píxeles de la imagen. Izqda: hojas del tratamiento Control. Dcha: hojas del tratamiento S3.
En la Figura 6, izquierda, se presentan los histogramas medios de las hojas de cada nivel de salinidad. Se comprueba cómo, según aumenta la concentración salina en la hoja, los histogramas se van desplazando hacia la derecha y se hacen, en general, más estilizados al concentrarse una mayor cantidad de píxeles en valores similares. Por otra parte la Figura 6 derecha muestra los rangos de los valores de las imágenes de cada tratamiento (media +/- rango intercuartil, caja azul, y rango total de los datos, líneas negras). Se pueden diferenciar bien los niveles de salinidad S2 y S3 entre ellos y respecto al Ct y al nivel S1. Lo que coincide con el comportamiento observado en los valores de contenido en agua de las hojas.
Figura 6: Izqda: histogramas medios de las hojas correspondientes a cada tratamiento salino. Dcha: distribución de los valores de la moda de las hojas de cada tratamiento salino y comparación de los valores medios y varianza entre cada tratamiento.
Por último, la clasificación no supervisada de los histogramas de las imágenes artificiales de las hojas, permitió considerar tres clases, presentando cada una de ellas el histograma medio que se presenta en la Figura 7. A la vista de esta representación cabría esperar que las hojas incluidas en la Clase 1 correspondieran a los tratamientos Ct y S1, mientras que la Clase 3 contuviera las hojas correspondientes a los estados extremos de salinidad. En la Tabla 1 se verifica esta hipótesis: 15 de las 16 hojas incluidas en la Clase 1 son hojas de los tratamientos Ct o S1, la Clase 2 8 de las 10 hojas del tratamiento S2, y la Clase 3 8 de las 10 hojas del tratamiento S3.
Figura 7: Histogramas medios correspondientes a cada clase según la clasificación no supervisada.
Tto. Ct
Tto. S1
Tto. S2
Tto. S3
Clase 1
8
7
1
Clase 2
2
3
8
2
Clase 3
1
8
Tabla 1: Número de hojas de cada tratamiento salino incluido en cada una de las clases obtenidas según la clasificación no supervisada de histogramas.
Conclusiones
En este trabajo se presenta una metodología para la evaluación de los efectos en hojas de lechuga ‘baby’ de diferentes concentraciones de salinidad en la solución nutritiva mediante el empleo de imágenes hiperespectrales. El procesado de las imágenes mediante diversos procedimientos que permiten la eliminación de la variabilidad interferente y la aplicación de métodos de análisis multivariante, ha permitido obtener imágenes virtuales que muestran el grado de afectación de cada píxel por la salinidad. En concordancia con el contenido en agua de las hojas, las imágenes hiperespectrales no distinguen entre hojas cultivadas en condiciones de no salinidad y aquellas sometidas a concentraciones de 50 mM NaCl. Sin embargo, los valores de presión osmótica sí se ven afectados a partir de la mínima concentración de sales aplicada.
Estos resultados permiten considerar viable la supervisión mediante técnicas de análisis de imagen de especies de hoja ‘baby’ cultivadas en condiciones controladas, para mantener los niveles de salinidad en el rango óptimo para conseguir un aumento de la vida útil del producto, sin comprometer su productividad ni su calidad fisiológica.
Agradecimientos
La financiación de este trabajo ha sido cubierta por el MICINN con los proyectos Multihort (AGL2008-05666-C02-01) y Babyleaf (AGL2010-20070). LPF-Tagralia es parte del Campus CEI Moncloa.
Bibliografía
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