Los cítricos son el principal cultivo frutal en el mundo
Aplicación de técnicas biotecnológicas para la obtención de variedades de mandarino
P. Aleza, J. Cuenca, A. García-Lor, M. Hernández, J. Guerri, J. Juárez, J. A. Pina, L. NavarroIVIA - Centro de Citricultura y Producción Vegetal23/10/2015
La obtención de variedades de mandarino que produzcan frutos sin semillas es indispensable para el mercado de consumo en fresco ya que los consumidores no aceptan la presencia de semillas en los frutos. La obtención de híbridos triploides es una estrategia que permite obtener variedades sin semillas ya que presentan muy baja fertilidad y normalmente no producen semillas ni inducen la formación de semillas en otras variedades por polinización cruzada. En este artículo se presenta el programa de mejora genética de mandarino que nuestro grupo está realizando en el IVIA junto con los diferentes avances biotecnológicos desarrollados que nos han permitido establecer y desarrollar un amplio programa de obtención de nuevas variedades de mandarino mediante hibridación sexual.
Introducción
Los cítricos son el principal cultivo frutal en el mundo con una producción estimada en el año 2012 de más de 131 millones de toneladas (FAO, 2015). En España también constituyen el principal frutal con una superficie de más de 384.000 Has y una producción superior a los 8,8 millones de toneladas (MAGRAMA, 2014). Nuestro país es el sexto productor del mundo y el primer exportador de fruta fresca, lo que convierte a los cítricos en una de las principales fuentes de entrada de divisas. La competencia en los mercados está aumentando últimamente debido a distintos factores, como la mejora de la calidad en la producción de países terceros, la mayor eficacia y rapidez de los medios de transporte a larga distancia y la apertura de los mercados como consecuencia de los acuerdos sobre Globalización y la PAC de la Unión Europea. A ello hay que añadir nuestros elevados costes de producción en relación con los países competidores por el mayor coste de la mano de obra, los cambios en los hábitos de consumo, la demanda de fruta de mayor calidad, la cada vez más amplia apetencia por productos sustitutivos y la concentración de la demanda en grandes empresas de distribución. Estos factores obligan a reconsiderar los planteamientos productivos del cultivo. El mantenimiento de la producción y competitividad del sector citrícola nacional depende en gran medida de la disponibilidad de material vegetal de alta calidad por lo que este aspecto tienen un carácter estratégico para nuestra citricultura.
En España se pueden distinguir tres grandes grupos de mandarinos: satsumas, clementinas e híbridos tipo mandarino. Las satsumas pueden recolectarse desde principios de septiembre hasta finales de diciembre, con la satsuma Owari, produciendo frutos sin semillas, ya que el polen y los óvulos presentan una viabilidad muy baja. Las clementinas son las variedades más representativas de la citricultura española por su calidad y aceptación por el consumidor. Hay muchas variedades, la mayoría obtenidas por selección de mutaciones espontáneas, que se recolectan entre mediados de septiembre y finales de enero. Las clementinas son mandarinas partenocárpicas, autoincompatibles y no se polinizan entre ellas, por lo que la fruta no tiene semillas. No obstante tanto el polen como los óvulos son viables, y pueden producir semillas por polinización cruzada con otras variedades de mandarino. Los híbridos tipo mandarino, fundamentalmente Fortune, Nova y Ortanique, se introdujeron en la citricultura española como consecuencia de la importante demanda de mandarinas tardías por los mercados internacionales. Son autoincompatibles y permiten prolongar la recolección hasta mayo. A pesar que presentan problemas como la dificultad de pelado y caracteres organolépticos claramente inferiores a las clementinas, tuvieron inicialmente una gran aceptación en los mercados y produjeron alta rentabilidad para los agricultores. No obstante, estas variedades tienen el gran inconveniente que permiten la polinización cruzada con las clementinas, lo que provoca la aparición de semillas en ambos grupos de variedades. Esto produce un importante problema comercial, ya que los consumidores no aceptan las mandarinas con semillas. Además, Fortune y Nova son susceptibles a la enfermedad de la mancha marrón de las mandarinas causada por el hongo Alternaria alternata.
Este hongo produce una toxina ACT, originada por un grupo reducido de genes ACTT localizados en un pequeño cromosoma prescindible del hongo (Ajiro et al. 2010) que afecta a los frutos, hojas y brotes de los mandarinos. Las hojas jóvenes son muy sensibles a la enfermedad y es frecuente la aparición sobre ellas de áreas necróticas que avanzan siguiendo las nervaduras de las hojas. Los frutos afectados presentan depresiones necróticas de tamaño variable y pústulas suberosas en la corteza que deprecian comercialmente la fruta para su consumo en fresco. Cuando las infecciones afectan a los frutos jóvenes en primavera, muchos sufren una abscisión prematura, lo que reduce notablemente la producción. Este hongo ha provocado el arranque o sobreinjerto de los árboles de estas variedades susceptibles. La consecuencia fue que durante las últimas décadas del siglo XX hubo una disminución de plantaciones de mandarinos de maduración tardía y el incremento de plantaciones de clementina, fundamentalmente Clemenules. Esto ha creado un grave problema, ya que hay una producción de clementinas superior a la demanda del mercado, lo que ocasiona una reducción drástica del precio pagado a los agricultores, que en muchos casos ni siquiera pueden vender su producción.
Recientemente, debido a la excesiva producción de clementina, muchos agricultores han decidido cultivar nuevas variedades tardías. Muchas de estas variedades están en fase de estudio y se conoce muy poco de ellas. Algunas no producen semillas y otras son susceptibles a Alternaria, aunque de momento los daños son relativamente bajos con los tratamientos adecuados. Además, están protegidas y gestionadas por empresas privadas que, en la mayoría de los casos, exigen unas condiciones y precios muy elevados que son difíciles de soportar por los agricultores, que en la práctica las hacen inaccesibles para los pequeños agricultores. Ante esta situación es necesario establecer programas de mejora genética públicos con el objetivo de producir nuevas variedades de mandarino mejor adaptadas a las demandas de calidad creciente de los consumidores, que no produzcan semillas en condiciones de polinización cruzada, que maduren durante todo el periodo de comercialización de mandarinas, que produzcan fruta de forma más eficiente y con menores costes de cultivo, que sean resistentes a los patógenos que originan importantes pérdidas económicas a los agricultores y que sean accesibles para todos ellos.
En este artículo presentamos el programa de mejora genética de mandarino que nuestro grupo está realizando en el Centro de Citricultura y Producción Vegetal del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) junto con los diferentes avances biotecnológicos desarrollados que nos han permitido establecer, optimizar y desarrollar un amplio programa de obtención de híbridos diploides y triploides de mandarino mediante hibridación sexual.
Obtención de híbridos triploides de mandarino mediante hibridación sexual
La gran mayoría de los cultivares de cítricos son diploides (2n=2x=18, plantas con 18 cromosomas), aunque variantes euploides, particularmente triploides (2n=3x=27, plantas con 9 cromosomas más que las plantas diploides) y tetraploides (2n=4x=36, plantas con el doble de cromosomas que las platas diploides), se encuentran de forma espontánea (Figura 1). En 1996 nuestro grupo empezó un programa de mejora genética dirigido hacia la obtención de variedades de mandarinos sin semillas, fundamentalmente mediante la producción de híbridos triploides. En la meiosis de las plantas triploides se originan asociaciones multivalentes y como consecuencia se producen gametos con distintas dotaciones cromosómicas que reducen la viabilidad de los mismos (Cameron y Frost 1968; Fatta Del Bosco et al. 1992). Por ello los híbridos triploides tienen muy baja fertilidad y normalmente no producen semillas ni inducen la formación de semillas en otras variedades por polinización cruzada. En cítricos la partenocarpia es un fenómeno común, por lo que la formación de semillas no es necesaria para obtener buenas producciones. Desde los años setenta del siglo pasado se conocía que podían obtenerse híbridos triploides de cítricos mediante hibridaciones sexuales entre parentales diploides y tetraploides (Cameron y Burnett, 1978; Esen y Soost, 1971; Esen et al., 1978). Se ha comprobado posteriormente que la obtención de híbridos triploides en cruzamientos entre parentales diploides está causada por la formación de gametos femeninos no reducidos (gametos 2n) (Aleza et al. 2015, Cuenca et al. 2015). No obstante, estas observaciones no pudieron aplicarse en programas de mejora hasta que se desarrollaron técnicas biotecnológicas como el rescate y cultivo de embriones in vitro, análisis del nivel de ploidía mediante citometría de flujo y obtención de nuevos parentales tetraploides (Aleza et al. 2010a; Aleza et al. 2012a; Aleza et al. 2012b).
Figura 1. Tinción de los cromosomas de cítricos mediante técnicas histológicas. Los diferentes cromosomas corresponden a los puntos coloreados en negro. a. Célula de una planta diploide de cítricos en la que se observan 18 cromosomas (2n=2x=18). b. Célula de un híbrido triploide con 27 cromosomas (2n=3x=27). c. Célula de una planta tetraploide de cítricos con 36 cromosomas (2n=4x=36).
La creación de nuevos parentales tetraploides es un punto muy destacado dentro del programa ya que permite la obtención de nuevas combinaciones de híbridos triploides que hasta el momento no se pueden efectuar. La obtención de plantas tetraploides se puede realizar mediante diferentes aproximaciones. En el germoplasma de los cítricos se pueden diferenciar genotipos apomícticos y no apomícticos. La gran mayoría de los cítricos son apomícticos excepto el cidro, zamboa o pummelo, clementinas y algunos híbridos de mandarino. Los genotipos apomícticos (poliembriónicos) producen semillas que contienen generalmente un embrión sexual y varios embriones nucelares que son genéticamente idénticos a la planta madre e impiden el desarrollo del embrión sexual. En estos genotipos, en las células de la nucela se produce la duplicación espontánea del número de cromosomas (embrionía adventicia) lo que permite identificar plántulas tetraploides en semilleros mediante citometría de flujo (Aleza et al. 2011). Siguiendo esta metodología actualmente disponemos de una gran colección de genotipos tetraploides de naranjo, mandarino, pomelo, limón y lima.
Las semillas de los genotipos no apomícticos (monoembriónicos) contienen únicamente un embrión de origen sexual. En estos genotipos la duplicación espontánea del número de cromosomas no se produce por lo que es necesario la utilización de otras tecnologías. En nuestro laboratorio hemos desarrollado una nueva metodología basada en el microinjerto y tratamiento de los ápices microinjertados con colchicina y orizalina y posterior selección de plantas no quiméricas mediante citometría de flujo (Aleza et al. 2009). Este método nos ha permitido regenerar plantas tetraploides estables de zamboa, cidro y diferentes genotipos de mandarino.
En las hibridaciones sexuales interploides, 2x X 4x y 4x X 2x, también es posible obtener híbridos sexuales tetraploides como consecuencia de la formación de gametos no reducidos del parental diploide. En estos momentos disponemos de un elevado número de híbridos tetraploides obtenidos a partir de hibridaciones intraespecíficas e intergenéricas que nos permiten obtener nuevas combinaciones entre los diferentes genomas de los cítricos compatibles sexualmente. La hibridación somática mediante fusión de protoplastos es otra metodología que nos permite obtener híbridos somáticos alotetraploides para su utilización como parentales en hibridaciones sexuales interploides. Posteriormente se describe con más detalle las aplicaciones de la hibridación somática en la obtención de variedades de mandarino.
Uno de los principales problemas de los programas de mejora genética de cítricos es la evaluación y selección de los híbridos. Los cítricos presentan un prolongado periodo juvenil (hasta 5-8 años) que ocasiona un largo proceso de evaluación y selección de muchos años y dificulta la mejora genética por métodos clásicos. Recientemente el grupo del Dr. J. Guerri del Departamento de Protección Vegetal y Biotecnología del IVIA ha desarrollado un vector viral basado en el genoma del virus del manchado foliar de los cítricos (CLBV) que expresa la proteína ‘Flowering Locus T’ de Arabidopsis thaliana e indujo la floración de plántulas de semilla a los cuatro meses de la inoculación (Agüero et al. 2012, Velázquez et al. 2014). El vector viral se multiplica en el meristemo y al expresar la proteína FT induce la floración. Este resultado es especialmente interesante para el acortamiento del periodo juvenil y puede ser una herramienta biotecnológica muy importante en la mejora genética de los cítricos. Actualmente disponemos de varios ensayos en parcelas experimentales del IVIA para evaluar los híbridos regenerados de una forma más rápida y descartar aquellos que produzcan frutos con peor calidad organoléptica. Además este vector es de gran utilidad para inducir la floración temprana de genotipos élite diploides y tetraploides para su utilización como parentales en hibridaciones sexuales.
Aplicaciónes de la hibridación somática a la obtención de nuevas variedades de mandarino
La hibridación somática mediante fusión de protoplastos es una técnica biotecnológica muy importante para la manipulación de los niveles de ploidía en programas de mejora genética. Esta técnica permite fusionar células somáticas de distintas variedades, géneros o especies originando plantas autotetraploides y alotetraploides con nuevas combinaciones genéticas que pueden ser utilizados como parentales en hibridaciones sexuales interploides. Es una técnica que ha permitido en los últimos años abordar objetivos de mejora que parecían inalcanzables a través de los métodos tradicionales. La hibridación somática permite obtener híbridos somáticos utilizando parentales estériles o sexualmente incompatibles. A través de esta técnica es posible obtener híbridos interespecíficos y también híbridos entre individuos de géneros afines, sexualmente incompatibles, superando así las barreras de la biología reproductiva (Grosser et al. 1988; Grosser et al. 1990a; Grosser et al. 1990b). En las hibridaciones sexuales dirigidas realizadas en los programas de mejora, es preferible utilizar parentales no apomícticos como parentales femeninos para facilitar el proceso de selección y rescate de los embriones, lo cual limita mucho el número de variedades que se pueden utilizar. En la hibridación somática esto no representa ninguna limitación, y en teoría cualquier parental puede ser empleado. La posibilidad de utilizar un mayor número de parentales ha permitido aumentar la variabilidad dentro del grupo de los cítricos así como la introducción de caracteres de interés desde las especies no cultivadas a las domesticadas. Este hecho es de fundamental importancia para los programas de mejora genética. En los híbridos somáticos siempre se transmiten los genes dominantes de ambos parentales, por lo cual es posible combinar genotipos complementarios que resulten más adaptados a las condiciones de cultivo. Al no tener lugar ningún mecanismo de recombinación meiótica no hay que enfrentarse a problemas de heterozigosis y además se evita la aparición de genes recesivos deletéreos que podrían expresarse en los casos de depresión por endogamia, como ocurre en la hibridación sexual.
La hibridación somática es una técnica que permite modificar de forma relativamente sencilla el genoma citoplasmático de la planta. Contrariamente a lo que ocurre con la hibridación sexual, el citoplasma de los híbridos somáticos es el resultado de la unión o reorganización de los citoplasmas de los dos parentales lo que nos permite explorar el potencial de esta metodología para el estudio de la interacción núcleo-citoplasma. En trabajos previos realizados en el laboratorio, hemos regenerado cíbridos (plantas con el núcleo procedente de un parental y con el citoplasma del otro parental) de diferentes combinaciones parentales y hemos observado en campo que estas plantas presentan cambios, en relación con el parental donante del núcleo, en aspectos relacionados con el contenido en ácidos totales, azúcares y época de maduración. El adelanto o retraso de la época de maduración sin cambiar otras características es un carácter de gran interés y un valor añadido muy importante para las variedades de cítricos proporcionándoles una ventaja comercial muy destacada al extender el periodo de recolección.
Selección asistida por marcadores moleculares
La evaluación de nuevas variedades es un factor limitante de cualquier programa de mejora de cítricos, por lo que es muy importante utilizar estrategias que permitan acortar y hacer más eficiente este proceso. Los marcadores moleculares son fragmentos de ADN ubicados en un determinado cromosoma que nos permiten mediante técnicas de laboratorio inferir el fenotipo de una planta a partir del genotipo (por ejemplo: resistencia o susceptibilidad a un determinado patógeno). Trabajos previos realizados por nuestro grupo han demostrado que la herencia de la resistencia a Alternaria está controlada por un alelo recesivo ubicado en un locus del cromosoma III. Esto nos ha permitido diseñar marcadores moleculares SSR y SNP para caracterizar los parentales de mayor interés y aplicar una estrategia de selección temprana asistida por marcadores moleculares (SAM) (Cuenca et al. 2013) de híbridos triploides resistentes a Alternaria en el caso de usar algún parental susceptible (Figura 2). El desarrollo de estos marcadores es una herramienta muy potente ya que nos permite seleccionar las plantas resistentes en fases muy tempranas del cultivo y ello conlleva un importante ahorro de espacio, tiempo y dinero.
Figura 2. Análisis genético susceptibilidad Alternaria con los marcadores moleculares AT21 y AAT9. Mandarino Fortune presenta el alelo de susceptibilidad a Alternaria mientras que el híbrido triploide analizado no lo presenta. Este análisis genético realizado a partir del ADN de las plantas nos permite diferenciar las plantas susceptibles de las resistentes en fases muy tempranas del cultivo y ello conlleva un importante ahorro de espacio, tiempo y dinero.
Conclusiones y perspectivas de futuro
Todas estas técnicas biotecnológicas nos han permitido establecer un programa de mejora genética asistido con marcadores moleculares en el que se han obtenido más de 17.000 híbridos triploides que están en distintas fases de evaluación y la producción a nivel comercial de los híbridos triploides Garbí (Aleza et al. 2010b) y Safor (Cuenca et al. 2010). Actualmente tenemos registrados 11 híbridos triploides y recientemente se ha solicitado la inclusión en el Registro de Variedades Protegidas de la Oficina Española de Variedades Vegetales (OEVV) de 12 nuevos híbridos triploides que permiten producir fruta sin semillas con excelentes propiedades organolépticas desde octubre hasta principios de abril y algunos de ellos resistentes a Alternaria (Figuras 3, 4 y 5). Estas variedades se incluirán en el nuevo Sistema de Experimentación de Variedades del IVIA para que todas aquellas entidades del sector citrícola que estén interesadas, puedan colaborar y participar en la experimentación de las nuevas variedades obtenidas en los programas de mejora genética del IVIA. Uno de los principales objetivos de este sistema de experimentación es conocer el comportamiento agronómico de las nuevas variedades en diferentes áreas climatológicas, cultivadas en diferentes tipos de suelo y con diferentes patrones ya que el comportamiento agronómico de las variedades está muy influenciado por estas características. Todos los híbridos triploides registrados se han caracterizado con marcadores moleculares y se ha desarrollado una base de datos para la identificación de todos ellos. Los marcadores moleculares nos permiten establecer una trazabilidad de los frutos y de las plantas propagadas en los invernaderos y defender los derechos del obtentor.
Figura 3. Híbrido triploide IVIA TRI-707 obtenido mediante polinización manual de Clemenules tetraploide y mandarino Page. En las parcelas experimentales que el IVIA tiene en Moncada puede ser recolectada a finales de octubre. Los frutos no presentan semillas, calibre alrededor de 55 mm con excelentes propiedades organolépticas.
Figura 4. Híbrido triploide Alborea obtenido mediante polinización manual entre mandarino Fortune como parental femenino y mandarino Wilking como parental masculino. Variedad resistente a Alternaria. En las parcelas experimentales que el IVIA tiene en Moncada puede ser recolectada a principios de enero. Los frutos no presentan semillas, calibre entre 55 y 60 mm con excelentes propiedades organolépticas.
Figura 5. Híbrido triploide IVIA TRI-705 obtenido mediante polinización manual entre mandarino Fortune como parental femenino y tangor Murcott como parental masculino. Variedad resistente a Alternaria. En las parcelas experimentales que el IVIA tiene en Moncada puede ser recolectada a finales de febrero. Los frutos no presentan semillas, calibre entre 60-65 mm con excelentes propiedades organolépticas.
El desarrollo de todas estas técnicas biotecnológicas junto con la genética y la genómica permitirán realizar programas de mejora genética más eficientes además de optimizar la transferencia de los caracteres de interés de los parentales a la progenie, profundizar en el conocimiento de los mecanismos genéticos que controlan caracteres de interés, aumentar el conocimiento sobre la biología reproductiva de los cítricos y desarrollar nuevos marcadores para una selección temprana de otros caracteres de interés. La obtención de variedades sin semillas que produzcan frutos con excelentes propiedades organolépticas altamente productivas que reduzcan los costes de producción, que maduren a lo largo de toda la campaña de producción, que presenten un adecuado comportamiento postcosecha y que lleguen a su destino en óptimas condiciones serán características necesarias para las nuevas variedades de mandarino. No hay que olvidar que los frutos cítricos suponen una fuente extraordinaria de compuestos con efectos beneficiosos para la salud como vitamina C, antocianos, carotenos, licopeno, ácido fólico, calcio, etc. En nuestro programa de mejora genética ya estamos realizando la selección de nuevos híbridos diploides y triploides con estas características ya que el desarrollo de nuevas variedades con alto contenido en estos compuestos biosaludables será de gran importancia en los nuevos proyectos de mejora genética.
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