55 BIOTECNOLOGÍA descrito por Petri et al. (2008). Se han produci- do diferentes líneas transgénicas conteniendo la construcción diseñada para silenciar los on- cogenes de Agrobacterium tumefaciens (Al- burquerque et al., 2012). Se realizaron las extracciones de ADN a partir de 100 mg de hojas de brotes micropropaga- dos in vitro de las posibles líneas transgénicas utilizando el protocolo publicado por Doyle y Doyle (1987). Para comprobar que las líneas ha- bían incorporado los transgenes se realizó una evaluación mediante PCR (polymerase chain reaction) Se utilizaron cebadores específicos para la amplificación del transgen nptII. El pro- ducto de la amplificación del ADN se detectó por electroforesis en un gel de agarosa 1% (p/v) y después de teñir con bromuro de etidio se visualizó bajo luz ultravioleta. Figura 3: Amplificación mediante PCR de un fragmento del gen nptII presente en plantas de ci- ruelo transformadas. Calle 1: control negativo; calles 2-7: diferentes líneas de ciruelo transgé- nicas; calle 8: agua, M: marcador molecular de ADN 1000 pares de bases, P: control positivo (plásmido). Para evaluar la resistencia de estas plantas a la agalla de corona se ha utilizado un protocolo que consiste en infectar brotes micropropagados in vitro de cada línea transgénica de ciruelo y brotes no transgénicos pinchando en el tallo una gota de solución de la cepa oncogénica de Agrobacte- rium C58 con D.O.600 = 0,3. Transcurrido un mes se ob- servó la aparición de síntomas o callogénesis. Los síntomas se diferenciaron en tres niveles: 0 o ausencia de callo, 1 o aparición de callo que no supera el diámetro del tallo del brote y 2 cuando el callo desarrollado es más gran- de que el diámetro del tallo (Figura 1). También se tomó el tamaño del callo. En el caso de los frutales la enfermedad provocada por Agrobacterium spp. afecta principalmente en la fase de vivero Para evaluar la resistencia a la enfermedad en el inverna- dero se enraizaron y aclimataron plantas de algunas líneas y de controles no transformados. Se infectaron siguiendo un protocolo descrito previamente (Cervera et al., 1998; Petri et al., 2004), que consiste en introducir en el tallo de cada planta 5 μL de una solución de la cepa oncogénica de Agrobacterium C58 con D.O.600 = 0,3. Transcurridas 8 se- manas se evaluó la aparición de síntomas o callogénesis y se tomó el peso de los callos generados (Figura 2). Plantas resistentes: resultados Tras los experimentos de transformación llevados a cabo con material de semillas de las variedades de ciruela ‘Claudia verde’, ‘Stanley’ y ‘Claudia Tolosa’ se aislaron yemas regeneradas en medio que contenía kanamicina como agente selectivo y se establecieron distintas líneas. La presencia del gen de resistencia a aminoglicósidos nptII se ha comprobado mediante PCR (Figura 3) en aque- llas líneas capaces de crecer en medio con 80 mg/L de kanamicina, resultando positiva en todas las líneas anali- zadas. El test desarrollado in vitro nos permitió evaluar un nú- mero elevado de líneas transgénicas. De 17 líneas esta- blecidas, 6 mostraron síntomas significativamente menores que los observados en los controles, siendo consideradas líneas tolerantes. En una de las líneas eva- luadas in vitro no se observaron síntomas (C103-6), y en otras dos fueron casi inapreciables (CT106-11 y S106-1), lo que indica que podrían ser resistentes a la agalla de la corona (Figura 4). En cuanto a los tamaños del callo ob- tecnología