29 VITICULTURA Fig. 6: Resultados de las reacciones de amplificación de trampas inoculadas artificialmente con esporas de mildiu, oidio y botritis, y con fitosanitarios para el tratamiento y control de las tres enfermedades, susceptibles de inhi- bir la reacción de PCR. Se testaron diferentes fungicidas para el control de mildiu, oidio y botritis, e incluso insecticidas, acaricidas, fertilizantes y adyu- vantes, como posibles inhibidores, a la misma dosis que la recomendada para su aplicación en el viñedo. Para cada caso: Calle a: reacción multiplex sin lavado de muestra. Calle b: reacción con lavado de las muestras previo a la extracción de ADN. La banda que amplifica a la altura de unos 200 pb se corresponde con P. viticola, y la que lo hace a unos 300 pb se corresponde con E. necator. Calle c: amplificación de B. cinerea a una altura de 200 pb tras una segunda ronda de amplificación. Calle (+): control positivo; Calle (-): control negativo. bandas aparecen tras una primera reacción de amplifica- ción. En cambio, para la identificación del microorganismo causante de botritis (B. cinerea) hace falta una segunda ronda de amplificación con el material obtenido en la pri- mera reacción para conseguir visualizar la banda corres- pondiente a las esporas de este hongo (Fig. 5). Tras la puesta a punto de la reacción de amplificación, se testaron diferentes fungicidas utilizados y autorizados en el control de las tres enfermedades. Para ello se inocula- ron artificialmente las trampas con un número de esporas determinado y se testaron diferentes fungicidas autoriza- dos y utilizados para el control de mildiu, oidio y botritis, e incluso insecticidas, acaricidas, fertilizantes y adyuvan- tes, como posibles inhibidores, a la misma dosis que la recomendada para su aplicación en el viñedo. Se utiliza- ron (Fig.6): 1: Oxicloruro de cobre 25% + Folpet 35% + Metalaxil 10%; 2: Oxicloruro de cobre 70%; 3: Copper 5%; 4: Sulfato pentahidratado de cobre; 5: Ciazofamida 2,3%; 6: Cimoxanil 4% + mancozeb 40%; 7: Folpet 37,5% + Iprovalicarb 6%; 8: Mandipropamid 5% + folpet 40%; 9: Mancozeb 64% + metalaxil-M 3,9%; 10: Pyra- clostrobin 5%, metiram 55%; 11: Piraclostrobin 6,7%+di- metomorf 12%; 12: Fosetil-Al 50%+cimoxanil 4%+folpet 25%; 13: Mancozeb 80%; 14: Penconazol 20%; 15: Mep- tildinocap 35%; 16: Tetraconazol 12,5%; 17: Microbutanil; 18: Azufre micronizado 98,5%; 19: Azufre 80%; 20: Te- buconazol 25%; 21: Metiltiofanato 45%; 22: Mepanipirim 50%; 23: Pirimetanil 40%; 24: Fenhexamida 50%; 25: Ci- prodinil 37,5%. fludioxonil 25%; 26: Ciprodinil 50%; 27: Dicofol 48%; 28: Flufenoxuron 10% p/v: 29: P2O5 12%. K2O 12%; 30: adyuvante no iónico 20%; 31: Peroxydisul- fato amonio potasio 39%. Favorece la detección de la enfermedad antes de la observación de síntomas en la planta Las trampas se lavaron mediante un protocolo que consta de varios lavados sucesivos con tampones de lavado de diferente composición, y posteriormente se procedió a la extracción del ADN para luego llevar a cabo la reacción Multiplex. Los resultados mostraron detección de las bandas corres- pondientes a las esporas de los patógenos a detectar, mientras que tras la reacción de muestras sin lavado pre- vio, la amplificación y consecuente detección resultaba aleatoria. Así, el método descrito supone el primer método de PCR libre de inhibidores para la detección e identificación si- multánea de esporas de P. viticola, E. necator y B. cine- rea. Favorece la detección de la enfermedad antes de la observación de síntomas en la planta. Supone una herra- mienta para la toma de decisión de aplicación de trata- miento que favorece la reducción de las aplicaciones de fungicidas, así como a un avance en la protección del cul- tivo y del medio ambiente, pues podría disminuirse el nú- mero de estas aplicaciones al reducirse la presión de inóculo antes de su dispersión masiva por el viñedo.I tecnología