28 VITICULTURA Fig. 4: (A) Dispositivo con trampas para la captura de esporas a dos alturas. (B) Detalle de trampas orientadas hacia los cuatro puntos cardinales. detección permite el control más localizado y evita la masiva disper- sión posterior de la enfermedad por la posibilidad de aplicar un tra- tamiento de control antes de que la enfermedad sea visible. En Neiker se ha desarrollado un método de detección simultánea de esporas de mildiu, oidio y botri- tis, basado en la captura pasiva de esporas y su identificación median- te la técnica de biología molecular de PCR Multiplex. Los dispositivos para la captura pasiva de esporas en campo constan de 4 trampas orientadas hacia los 4 puntos cardinales, y a 100 cm del suelo (Fig. 4). Las trampas consisten en portaobjetos im- pregnados de una sustancia adherente inerte, que son re- emplazadas periódicamente. La mencionada técnica molecular desplaza a la técnica de microscopía óptica bajo luz visible. Ésta consiste en la ob- servación al microscopio previa tinción con lactofucsina ácida (0,1% lactofucsina ácida en ácido láctico). La técni- ca microscópica permite la diferenciación morfométrica de las esporas y la identificación de la especie fúngica. Pero resulta una técnica a menudo poco objetiva, ya que la morfología de algunas esporas puede ser confundida con otras similares, pueden ser enmascaradas por otras estructuras (polvo, polen) y se prolonga en el tiempo, pues consume más tiempo que las técnicas moleculares para la obtención de un resultado. La PCR-Multiplex consiste en una reacción de amplifica- ción de material genético para la identificación simultánea de las esporas de los tres microorganismos. Este método consiste en la amplificación de una secuencia de ADN (Ácido Desoxirribo Nucleico) de cada patógeno y que se encuentra en las esporas. Estas esporas llegan al laboratorio de diagnóstico pegadas en las trampas dis- puestas en la viña para su captura, y como se ha descrito previamente. Previamente a la amplificación de ADN, se requiere la ex- tracción del mismo de las esporas que lo contienen, y que ésta sea lo más limpia posible para que no se produzcan interferencias en la amplificación para su posterior visua- lización en los geles de agarosa. Así, esta técnica incluye la eliminación mediante lavados específicos de posibles inhibidores de la reacción de amplificación que pueden estar presentes en las trampas de captura de esporas re- cogidas en campo (restos de suelo, restos de fungicidas, polen, esporas de otros hongos, etc.) y que supone el la- vado de las mismas previo a la lisis de esporas y posterior obtención del ADN. Tanto en el caso del microroganismo causante de mildiu (P. viticola) como del causante de oidio (E. necator), las Fig. 5: Bandas en gel de agarosa tras la amplificación del material genético procedente de esporas capturadas en trampas de impacto en campo. Calle 1: control negativo, indicador de ausencia de contaminación exógena. Calle 2: amplificación del material genético de esporas de los tres patógenos respon- sables del mildiu (208 pb) y oidio (367 pb). Calle 3: banda correspondiente a botritis (237 pb) tras la amplificación del producto obtenido en la primera PCR. Calle M: marcador de peso molecular. tecnología